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研究背景与目的胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,胃癌发生的机制并未完全阐明。肿瘤的发生发展是一个多步骤过程。一般来说,肿瘤的发生与遗传学和表观遗传学密切相关,DNA甲基化是重要的表观遗传学修饰。肿瘤的发生发展过程中,会出现一个DNA甲基化状态的转变,一些启动子区域的CpG岛被甲基化,导致启动子区域所在的基因的表达沉默,这个过程是肿瘤发展的关键步骤。人类的细胞中,70–80%的CpG二核苷酸是高甲基化的。然而CpG岛应该是非甲基化的,人类有大约60%的基因与CpG岛有关。正常非甲基化CpG岛的异常甲基化与基因突变、基因缺失的作用一样,均与转录失活有关。胃癌存在许多抑癌基因启动子不同程度的高甲基化。非甲基化的CpG岛在肿瘤细胞可能转变为甲基化的CpG岛,并导致基因功能丧失。RUNX3基因位于染色体1p36.1。RUNX3基因的表达产物与Smad结合,协同调节多个靶基因。人类RUNT相关转录因子是TGF-β超家族信号的重要靶点。在哺乳动物Runt结构域转录因子家族包括3个成员,分别是RUNX1、RUNX2和RUNX3,它们1个共同的氨基末端结构域。前两个成员分别与人类急性白血病和锁骨发育不良等疾病相关。RUNX3作为RUNX转录因子家族成员,具有抑癌基因的功能。RUNX 3是新型的抑癌基因,RUNX3在胃癌中常因启动子高甲基化而沉默。近期的研究表明,胃癌细胞RUNX3表达由于启动子高甲基化或杂合子缺失而明显下调。5氮杂胞嘧啶(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)是特异性DNA甲基转移酶抑制剂,可逆转因高甲基化而沉默的基因。本研究应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR, MSP)技术检测5-Aza-dC对胃癌细胞SGC-7901 RUNX3 CpG岛的甲基化状态的效应,应用Real-time-RT-PCR技术检测其对RUNX3 mRNA水平的效应,应用流式细胞技术(flow cytometry, FCM)检测其对细胞周期的效应,探讨5-Aza-dC是否可逆转RUNX3 CpG岛的高甲基化,恢复RUNX3基因的功能。研究方法1.细胞培养:胃癌细胞系SGC-7901培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,37℃,50ml/L CO2,饱和湿度的细胞培养箱中培养。每1d换液1次,每3d传代1次。2.5-Aza-dC对胃癌细胞SGC-7901 RUNX3基因启动子CpG岛甲基化状态的效应:以12μmol/L的5-Aza-dC培养胃癌细胞SGC-7901 72 h,提取基因组DNA,应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR, MSP)技术检测5-Aza-dC对RUNX3基因启动子CpG岛甲基化状态的效应。3.5-Aza-dC对胃癌细胞SGC-7901 RUNX3基因mRNA的效应:分别以1.5μmol/L、3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L的5-Aza-dC培养胃癌细胞SGC-7901 72 h,提取各组细胞总RNA,应用Real-time-RT-PCR技术检测5-Aza-dC对胃癌细胞SGC-7901 RUNX3 mRNA的效应。4.5-Aza-dC对胃癌细胞SGC-7901细胞周期的效应:分别以1.5μmol/L、3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L的5-Aza-dC培养胃癌细胞SGC-7901 72 h,收集细胞,应用FCM技术检测5-Aza-dC对胃癌细胞SGC-7901细胞周期的效应。5.统计学处理:所有数据以均数±标准差( x±s)表示,应用SPSS18.0统计软件处理数据, P<0.05为差异有显著性。结果1. 5-Aza-dC对胃癌细胞SGC-7901 RUNX3基因启动子CpG岛甲基化状态的效应: MSP结果显示,胃癌细胞SGC-7901 RUNX3基因启动子CpG岛为甲基化状态;12μmol/L的5-Aza-dC作用72h后,RUNX3基因启动子CpG岛由甲基化状态转变为非甲基化状态。2. 5-Aza-dC对胃癌细胞SGC-7901 RUNX3基因mRNA的效应:Real-time- RT-PCR结果显示,胃癌细胞SGC-7901 RUNX3 mRNA水平较低,5-Aza-dC作用72h后1.5μmol/L、3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L RUNX3的mRNA相对表达量分别为0.32±0.05、0.95±0.07、1.22±0.052和1.85±0.03,RUNX3的mRNA水平以浓度依赖方式增加。RUNX3 mRNA水平与5-Aza-dC的浓度呈显著性正相关(r>0.95,P<0.05)。3. 5-Aza-dC对胃癌细胞SGC-7901细胞周期的效应:FCM结果显示,5-Aza-dC作用72h后,胃癌细胞SGC-7901阻滞于G0/G1期;G0/G1期细胞比率以浓度依赖方式增加。G0/G1期细胞比率与5-Aza-dC的浓度呈显著性正相关(r>0.95,P <0.01)。结论5-Aza-dC可逆转胃癌细胞SGC-7901 RUNX3基因CpG岛的甲基化状态,上调RUNX3基因表达,诱导胃癌细胞处于G0/G1期阻滞。