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目的1.制备具有不同晶体结构的二氧化钛(Ti O2)高性能纳米纤维,观察其对宫颈癌肿瘤细胞系He La细胞的光动力作用影响,探讨其作为光敏剂潜在应用于临床光动力治疗的可行性。2.通过宫颈癌患者光动力治疗后的基因表达谱芯片筛选靶基因MPP8,通过细胞实验检测其在He La细胞增殖和凋亡中的作用。3.检测Ti O2复合纳米纤维的光动力作用后He La细胞MPP8的表达差异,探讨Ti O2复合纳米纤维作为光敏剂在肿瘤光动力治疗中的相关作用机制。方法1.将层状钛酸盐H2Ti3O7纳米纤维经煅烧过程和水热反应高温及热处理,制作不同晶型的Ti O2复合纳米纤维(锐钛矿、Ti O2(B)相、以及锐钛矿/Ti O2(B)混相结构),并利用X射线衍射仪(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)对所得到的新型复合纳米纤维进行表征解析。2.将制备的纳米纤维加入至宫颈癌肿瘤细胞系He La细胞中一起培养;荧光显微镜观察贴壁He La细胞的形态学变化;MTT实验检测He La细胞在光动力作用之后的增殖变化;流式细胞仪检测纳米纤维在光动力作用下对He La细胞凋亡的影响。3.分析宫颈癌患者光动力治疗后的基因表达谱芯片,筛选靶基因M-期磷蛋白8(M-phase phosphoprotein 8,MPP8);免疫组化检测MPP8在宫颈癌患者光动力治疗组与非治疗组中的表达差异。4.利用靶向MPP8基因沉默的RNAi慢病毒载体感染He La细胞,含嘌呤霉素的选择性培养基筛选稳定干扰MPP8的He La细胞,构建稳定沉默MPP8基因的人宫颈癌He La细胞株;利用MTT实验、克隆形成实验和流式细胞仪观察MPP8对He La细胞增殖与凋亡的影响。5.利用Western blot及q RT-PCR检测经Ti O2复合纳米纤维的光动力作用后He La细胞MPP8的表达差异,探讨Ti O2复合纳米纤维作为光敏剂在肿瘤光动力治疗中的相关作用机制。结果1.通过对H2Ti3O7纳米纤维的煅烧和水热处理,分别制备得到四种晶型的Ti O2纳米纤维:单晶Ti O2(B)(T(B))、单晶anatase(T(A))、煅烧混相anatase/Ti O2(B)(T(AB)-T)、水热煅烧混相anatase/Ti O2(B)(T(AB)-H),并通过XRD、SEM、TEM等方法准确证实了这些Ti O2纳米纤维的晶型结构和一维度形貌特征。2.将制备的Ti O2纳米纤维光敏剂与He La细胞共培养后,显微镜下观察到它们有向He La细胞内聚集的趋势,并具有较好的生物相容性。MTT实验检测了四种晶型纳米纤维与He La细胞共培养后,He La细胞的增殖变化:无光动力作用存在时,纳米纤维对He La细胞的增殖没有影响,而在光动力作用下He La细胞增殖明显受抑,且四种纳米纤维的光动力作用之间也存在差异,其中T(AB)-H效率最高。流式细胞仪检测了纳米纤维作为光敏剂进行光动力作用后对He La细胞凋亡的影响,结果显示四种纳米纤维的光动力作用使得He La细胞的凋亡显著增加并存在组内差异。3.临床宫颈癌病人光动力治疗后的基因表达谱芯片检测显示,MPP8在癌组织中较癌旁组织显著升高。免疫组化显示MPP8在临床宫颈癌病人光动力治疗与非治疗组之间存在表达差异,光动力治疗组MPP8表达较低;Western blot及q RT-PCR检测也显示经Ti O2复合纳米纤维的光动力作用后He La细胞的MPP8表达降低。4.利用靶向沉默MPP8基因的RNAi慢病毒载体感染He La细胞,之后利用含嘌呤霉素的选择性培养基筛选出了稳定干扰MPP8的He La细胞,成功构建了稳定沉默MPP8基因的人宫颈癌He La细胞株。荧光显微镜下观察到感染效率达70%以上,q RT-PCR和Western blot证明MPP8表达水平下降了约65~70%。5.MTT结果证明He La细胞在沉默MPP8基因后增殖受到显著抑制,克隆形成实验结果显示MPP8沉默组的He La细胞集落数量及克隆形成率明显降低。流式细胞仪细胞周期检测结果显示MPP8的沉默导致了He La细胞的周期阻滞,说明MPP8可通过对细胞周期的影响而对He La细胞的增殖产生影响。细胞凋亡检测结果显示MPP8沉默后He La细胞的凋亡比率明显升高,推测MPP8可抑制He La细胞的凋亡。结论1.制备了具备潜在应用价值可用于临床光动力治疗的新型二氧化钛(Ti O2)复合纳米纤维光敏剂,其具有较好的生物相容性,并在光动力作用下可引起宫颈癌肿瘤细胞系He La细胞的凋亡。2.发现了具有临床应用价值的差异表达基因M-期磷蛋白8(MPP8),可能为潜在的肿瘤标记物及光动力治疗的潜在靶点,对光动力治疗作用机制提供了理论依据。3.构建了稳定沉默MPP8基因的人宫颈癌He La细胞株,MPP8在靶向沉默后可导致He La细胞的周期阻滞并引起He La细胞的凋亡比率上升,推测MPP8在宫颈癌的恶性增殖中发挥较为重要的作用。