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玉米是对盐分中度敏感的作物,土壤盐渍化是降低其产量的主要环境因素之一,因此,培育耐盐玉米品种具有重要的意义。采用传统的育种方法选育耐盐品种极为缓慢。随着分子生物学技术的发展,人们可以用基因工程技术提高植物的耐盐碱性。提高植物抗盐性最根本、最经济、最有效的方法是充分利用抗盐基因,培育新的高抗盐品种。自从1988年Rhodes等首次获得玉米转基因完整植株以来,玉米转基因在受体系统的建立,转化技术的研究和重要的农艺性状的遗传改良方面都取得重大进展,在育种改良中起着愈来愈重要的作用。 本文采用玉米常用自交系的幼胚为受体材料,对耐盐碱基因的遗传转化进行了研究,为培育出高度耐盐碱的玉米新品种打下良好基础;并在此基础上进行了玉米愈伤组织及苗耐盐碱性敏感性研究,确定玉米愈伤组织及幼苗在含盐培养基上临界浓度,对已转化的愈伤组织及幼苗进行筛选和几项重要生理指标的鉴定。评价转BADH和CMO基因玉米耐盐碱的能力。取得的主要研究结果如下: 一、玉米遗传转化方法研究 1.玉米耐盐基因的农杆菌转化的研究 本试验中用于转化的抗盐碱基因为胆碱单加氧酶基因(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)。以普通玉米自交系H99和7922的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对碱性盐的敏感性实验,确定愈伤组织适宜选择压。利用农杆菌介导法将抗盐基因导入玉米自交系中,研究农杆菌转化系统的优化,探讨不同的侵染时间、不同的菌液的浓度等条件对转化效果的影响。结果表明,浓度(OD值)在0.5-0.6左右,侵染25分钟时的愈伤组织的侵染效果最好,转化率较高,并采用浓度为36mmol/L的含盐培养基对其进行筛选,同时将转化的愈伤组织进行分化出苗后进行PCR-Southern杂交,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。 2.玉米耐盐基因花粉管通道法转化研究 本实验还采用了花粉管通道法对玉米自交系进行遗传转化。将抗盐基因转入玉米自交系5003、春09、7922中,同时探讨了不同导入时间、不同DNA的浓度、不同的导入量等对其转化率的影响,并从中得出花粉管通道法的最佳转化条件。用SSC溶解的质粒,导入的最佳时间在早上6:00-8:30时、下午4:00-7-00时,导入间隔时间要在8-20小时范围内,并且导入质粒的浓度为500μg/mL、导入量为200μl即可达到较高的转化率,通过转化植株后代的PCR-Southern杂交分析,证明了抗盐基因已整合到受体植株的基因组中,并在后代中得以表现。