背景骨肉瘤是最常见的起源于间叶组织的原发性恶性肿瘤。其恶性程度高,复发转移率高,致死率高。近年来,随着辅助化疗及外科技术的应用及水平的提高,骨肉瘤的治疗效果有了比较明显的改善,但复发和转移仍是难以解决的两大问题。其中,骨肉瘤死亡患者80%-90%的死亡原因是由于发生了远端转移(特别是肺转移)。因此,探究骨肉瘤的肺转移相关机制,寻找新的,有效的骨肉瘤的诊疗方法成为了骨肉瘤诊疗工作中的迫切需求。mi RNA的大小约21-23nt,是一类不参与翻译转录蛋白质的单链小分子RNA。在转录后水平或翻译水平,mi RNA互补或不完全互补m RNA从而对基因表达起到调控作用。从1993年被发现到现在,一千多种mi RNA分子已被发现并深入研究。越来越多的研究证明,mi RNA参与了一系列重要的生命过程进程,包括生长,增殖,器官分化,程序性死亡和生长抑制等各个方面。其中,已有文献报道,mi RNA的表达与恶性肿瘤的发生,发展和转移有着极其重要的关系,同时又由于其表达具有高度的时序性、保守性和组织特异性,故mi RNA被认为是一种新的有重要意义的肿瘤发生及转移的生物标志物。mi RNA-194在很多人类肿瘤,特别是消化道肿瘤中低表达,提示mi RNA-194在人类肿瘤细胞中可能扮演抑癌基因的角色。但是,mi RNA-194在人骨肉瘤中的作用及具体作用机制尚不明确。本实验拟将mi RNA-194作为本次研究的研究目标和研究对象,寻找mi RNA-194在两种骨肉瘤细胞系SOSP-9607和U2-OS中所发挥的作用,并对其作用机制进行相关探索,并通过裸鼠及临床样本实验进行验证和进一步研究。目的研究和探讨mi RNA-194在人骨肉瘤中的作用及其可能的作用机制,并从分子层面分析、比较mi RNA-194分子对骨肉瘤生物学性状的影响,从而为临床对骨肉瘤进行早期诊断和分子靶向治疗提供理论依据和治疗靶点,从而为骨肉瘤相关转移机制提供新的研究思路和实验基础。方法(1)根据已有的基因芯片结果,使用荧光实时定量PCR测定mi RNA-194在来自同一母系细胞系但具有不同转移潜能的骨肉瘤细胞系F4和F5M2中含量,比较其差异,观测其是否有统计学意义,从而为研究mi RNA-194在骨肉瘤中转移的作用提供依据;(2)在SOSP-9607和U2-OS两种骨肉瘤细胞系中,利用构建好的慢病毒载体进行转染和筛选,达到稳定上调和下调mi RNA-194表达量的目的。对照组设为2组,为空白病毒转染对照(随机病毒转染)和空白(不转染任何核苷酸)对照组。实验共分4组。(3)在SOSP-9607和U2-OS两种骨肉瘤细胞系中,检测mi RNA-194对骨肉瘤细胞的增殖(MTT法,平板细胞克隆法)、周期(流式细胞仪法)、凋亡(流式细胞仪法)、转移(transwell法,划痕实验法)等生物学特征的影响。(4)在动物实验中(裸鼠实验),研究和探讨mi RNA-194在骨肉瘤的原位成瘤,特别是肺转移中所起的重要作用。(5)在骨肉瘤临床新鲜标本和石蜡样本中,测量mi RNA-194及其靶基因的表达量,通过与临床相结合,观察其与性别,肿瘤大小,转移等指标的关系,并通过生存分析等方法,观察其与患者生存情况的关系。(6)通过三个主流的生物信息学网站,采集相关信息,预测和分析mi RNA-194在人骨肉瘤中的作用机制(靶基因),使用荧光基因报告系统对可能的靶基因进行验证并进一步从基因水平(实时定量PCR法)和蛋白水平(western法)进行验证。并通过免疫组化等方法进一步证实mi RNA-194和靶基因的关系。结果(1)荧光实时定量PCR结果显示:mi RNA-194在F4和F5M2两个细胞系中的表达量有明显差异,且在转移潜能高的F5M2中的含量明显降低(p<0.01)。(2)通过荧光显微镜结果显示,通过慢病毒转染和嘌呤霉素筛选后,得到稳定上调和下调mi RNA-194的骨肉瘤细胞系,转染效率大于90%。实时定量PCR进一步证实:经转染和筛选后,各组细胞实验组中mi RNA-194表达量有显著差异(p<0.001)。(3)在体外水平,在SOSP-9607和U2-OS中,mi RNA-194表达量下调的细胞均增殖明显加快,转移能力明显增强,并且具有最低的G0/G1期细胞比率和凋亡率(p<0.05)。(4)在裸鼠体内,mi RNA-194表达量升高的细胞的原位成瘤能力和肺转移能力均明显降低(p<0.05)。(5)通过生物信息学方法进行预测并结合靶基因的功能进行分析,预测CDH2和IGF1R为mi RNA-194可能的靶基因。利用荧光素酶基因报告实验,发现与对照组相比,mi RNA-194的上调可以明显降低载有CDH2和IGF1R基因3’-UTR的荧光报告基因的荧光强度,而下调可以明显增强其强度。同时,Western blot检测显示CDH2和IGF1R相关的蛋白在mi RNA-194含量变化的影响下均有明显改变(p<0.05)。而在基因水平没有明显差异(p>0.05)。(6)通过107例新鲜骨肉瘤组织样本(含瘤旁组织)与99例石蜡样本检测,结果测显示,mi RNA-194与年龄,肿瘤大小,转移,是否存活等因素有关,并且和生存预后成明显的负相关。免疫组化显示mi RNA-194和CDH2、IGF1R基因有明显的负相关关系(p<0.01)。结论(1)mi RNA-194在骨肉瘤细胞系中与骨肉瘤的转移潜能有密切关系。(2)成功构建了能够稳定传代的,过表达以及抑制表达mi RNA-194的骨肉瘤细胞系,为进一步进行相关功能实验奠定了良好的实验基础。(3)在体外水平,mi RNA-194发挥着抑癌基因的作用。mi RNA-194可以显著地促进骨肉瘤细胞的凋亡并对其增殖和转移能力起抑制作用。(4)在动物实验中(裸鼠实验),mi RNA-194对骨肉瘤细胞的原位成瘤能力和肺转移能力起到显著的抑制作用。(5)预测并验证了2个mi RNA-194的靶基因:CDH2和IGF1R,从而对研究和解释mi RNA-194在骨肉瘤中的作用机制提供了依据和新的思路。(6)在临床标本和石蜡样本中,mi RNA-194和年龄,肿瘤大小,转移,是否存活等因素有关。并与骨肉瘤患者的生存预后呈明确的负相关关系。并进一步验证了mi RNA-194和靶基因CDH2和IGF1R的关系。