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乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的急性的蚊虫传播人畜共患病。乙型脑炎的主要特点是中枢神经系统(Central nervous system,CNS)广泛的炎症,并伴随着血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)完整性的破坏。虽然在病理学上,乙型脑炎病毒感染导致急性脑炎和血脑屏障的破坏,但是其机制仍不清楚。本研究利用JEV感染的体内和体外模型,探讨了JEV感染导致血脑屏障破坏的机制。结果显示,JEV感染小鼠后,在外周只有第1天和第2天能检测到少量残余的病毒,随后无法检测到病毒,说明外周的病毒很快被清除;在中枢神经系统中,JEV感染后第2天就能检测到病毒,在第4天病毒载量急剧增加,第5天基本达到顶点。血脑屏障通透性检测发现,通透性的极显著增加发生在JEV感染后第4天。以上结果说明乙型脑炎病毒在外周器官中未大量复制,部分病毒在未改变血脑屏障通透性的情况下入侵中枢神经系统,并在中枢神经系统中大量复制,引起血脑屏障的破坏,最终导致小鼠死亡。在脑组织中,IP-10、IFN-γ、IL-6和CCL4的表达量在感染后第1天就有极显著的增加,而CCL2和CCL3的表达量在第3-4天开始有显著增加。CCL5的表达量在JEV感染的第3天有约15-20倍的增加;而TNF-α表达量在第4天有极显著的增加。利用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3作为血脑屏障单层细胞模型的体外研究发现,乙型脑炎病毒感染小鼠的脑匀浆上清无论乙型脑炎病毒是否灭活,均能破坏内皮细胞的完整性,证实了是炎性因子而不是乙型脑炎病毒自身增加了血脑屏障的通透性。本课题首先进行了IFN-γ中和实验,以探究在本实验模型中IFN-γ对血脑屏障的破坏。结果显示,中和IFN-γ之后能够明显减少JEV感染情况下紧密连接蛋白的表达下调,说明IFN-γ在破坏血脑屏障过程中发挥重要作用。进一步实验发现中和IFN-γ是通过减少紧密连接蛋白的表达下调来维持血脑屏障的完整性。考虑到IP-10在感染后第1天就有极高的表达量,随后一直维持高表达,是乙型脑炎病毒感染后中枢神经系统中变化最早且最显著的因子。IP-10中和实验显示中和IP-10能够减轻血脑屏障的破坏,减少紧密连接蛋白的表达下调,说明IP-10和IFN-γ均位于JEV感染诱导的细胞因子网络的中心。通过检测乙型脑炎病毒感染小鼠后IP-10在脑组织中的表达发现星形胶质细胞是乙型脑炎病毒感染后IP-10的主要来源,神经元和小胶质细胞也能产生部分IP-10。利用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3的研究发现IP-10并没有破坏内皮细胞的完整性,因此推测IP-10是通过调节其他炎性因子的表达,进而破坏血脑屏障的完整性。通过分析IP-10与其他炎性因子表达及血脑屏障破坏时空关系,发现TNF-α极有可能位于IP-10下游。进一步用IP-10和乙型脑炎病毒处理星形胶质细胞,均能在处理后的细胞上清中检测到较高水平TNF-α,而中和IP-10之后能够明显下调TNF-α的表达,说明IP-10通过自分泌或旁分泌的途径作用于星形胶质细胞,从而产生TNF-α。TNF-α是通过改变内皮细胞的跨内皮通透性,调节内皮细胞紧密连接蛋白的表达和转位,进而影响血脑屏障内皮细胞的通透性。进一步研究发现,乙型脑炎病毒感染能够诱导星形胶质细胞上调表达IP-10的受体CXCR3。IP-10与受体CXCR3结合之后,能够激活MAPK信号通路。IP-10主要激活并磷酸化JNK(c-Jun N-terminal kinase),使其下游的立即早期转录因子c-Jun磷酸化,进而诱导TNF-α的表达。而TNF-α直接破坏血脑屏障的完整性,外周免疫细胞更容易进入中枢神经系统并能引起中枢胶质细胞的活化,最终强烈的炎性风暴导致了小鼠的死亡。综上所述,乙型脑炎病毒感染主要是通过诱导炎性因子,导致血脑屏障完整性的破坏,进而引起动物的死亡。乙型脑炎病毒感染产生的IFN-γ能够直接增加血脑屏障的通透性,而产生的IP-10并不直接作用于血脑屏障内皮细胞,而是通过诱导下游的炎性因子来增加血脑屏障的通透性。在中枢神经系统中,星形胶质细胞是IP-10的主要来源。IP-10通过结合其受体CXCR3,激活JNK-c-Jun信号通路,进而诱导TNF-α的表达。而TNF-α是通过改变内皮细胞紧密连接蛋白的表达与胞内分布来调控血脑屏障的通透性。阐明IP-10/TNF-α细胞因子网络诱导的BBB破坏能够为黄病毒科其他致脑炎病毒的发病机制提供借鉴,也能够为BBB相关的CNS疾病的治疗提供潜在的治疗靶点。