背景:孢子丝菌复合体是全球分布的双相真菌,主要包含6个亲缘种,其中球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌为主要的临床致病菌。不同的种在地域分布、致病力、传播途径等方面均存在一定的差异。孢子丝菌通过侵袭皮肤、皮下组织及附近淋巴系统,导致人类和其他动物的慢性感染,引起孢子丝菌病,其临床表现多样,严重程度不一。孢子丝菌病的临床诊断主要通过真菌培养及组织病理学检查。目前,一些基于核酸扩增技术的分子生物学方法逐渐应用于孢子丝菌病的诊断,但仍存在耗时长、灵敏度低、操作复杂等缺点。研究表明,孢子丝菌病的发病率逐年上升,引起众多研究学者的关注。我国东北地区是孢子丝菌病的高发地区,几乎全部由球形孢子丝菌引起。球形孢子丝菌遗传差异小,常规方法难以进行种内区分,其群体遗传结构尚未阐明。为了解析我国球形孢子丝菌的遗传多态性,弥补孢子丝菌临床快速诊断方面的不足,本研究拟采用具有高分辨能力的微卫星长度多态性分型技术对我国球形孢子丝菌群体遗传结构进行分析,并建立孢子丝菌实时荧光PCR检测方法,希望为孢子丝菌流行病学监控及快速诊断提供有力的工具。方法:1、球形孢子丝菌群体遗传学分析(1)收集来自中国不同地区的球形孢子丝菌120株并进行鉴定。(2)基于球形孢子丝菌基因组测序结果,分离微卫星座位并设计引物。(3)通过梯度PCR明确每个微卫星标记的最佳扩增条件。检测部分样品,筛选出具有遗传多态性的微卫星标记。(4)运用优化后的标记及反应条件检测120个临床分离株,通过生物信息学软件分析数据。2、球形孢子丝菌实时荧光PCR检测方法的建立及初步评价(1)比对NCBI数据库中所有孢子丝菌内转录间隔区序列,设计引物及探针。(2)优化反应体系。(3)通过球形孢子丝菌、其他常见致病真菌、细菌以及人类基因组DNA进行特异性、敏感性、最低检测限的检测,构建标准曲线。(4)通过球形孢子丝菌感染的临床标本评估检测能力。3、孢子丝菌病多重实时荧光PCR诊断方法的建立及初步评价(1)比对NCBI数据库中所有孢子丝菌钙调蛋白序列,设计引物及探针。(2)优化反应体系。(3)通过球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌、其他常见致病真菌、细菌以及人类基因组DNA进行特异性、敏感性检测。(4)通过标准浓度的阳性质粒进行最低检测限的检测,构建标准曲线。(5)通过单一荧光及多重荧光、单一样本及混合样本的比较;临床标本及模拟感染样本,对多重实时荧光PCR检测体系进行评估。结果:1、球形孢子丝菌基因组中发现200个微卫星位点,其中10个位点能够稳定扩增。每个基因座的等位基因数量范围为3到13,平均值为5.50,中等PIC值为0.441,10个位点的累积鉴别能力为1.0000。STRUCTURE分析确定最佳的K值为3,即呈出三个不同谱系。长春菌株在三个谱系中均有发现,大连和重庆的菌株只发现两个谱系。谱系II包含三个地区的菌株。引起固定型和淋巴型的菌株,三个谱系中均有分布。由于标本量不足,无法明确引起播散型孢子丝菌病的菌株群体的状况。PCo A分析支持STRUCTURE分析的结果,表明球形孢子丝菌的种群分为三个谱系。AMOVA结果表明,按照地域分布划分的组比按临床类型划分的组遗传变异更显著。2、球形孢子丝菌实时荧光PCR检测方法灵敏度及特异性均为100%,检测下限10fg,30例临床标本检测阳性率为100%,Ct值34.3-39.24。3、孢子丝菌病多重实时荧光PCR诊断方法对于球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌灵敏度及特异性均为100%,检测下限分别为10、10、100 copies。在相同模板量和反应条件下,单重实时荧光PCR的Ct值为21.67±0.15、24.64±0.15、27.00±0.11,多重实时荧光PCR的Ct值分别为21.80±0.07、24.77±0.07、27.32±0.08。在不同比例模板混合下,能够对相应的模板进行检测。33例临床确诊标本中,培养、普通PCR以及本研究的多重实时荧光PCR的阳性率分别为87.9%(29/33)、39.4%(13/33)、93.9%(31/33)。多重实时荧光PCR与培养检测阳性率差异不具有统计学意义(χ~2,p=0.4142),与特异性引物PCR检测阳性率具有统计学意义(χ~2,p<0.0001)。模拟标本检测阳性率均为100%,Ct值分别为33.03-38.57及30.23-34.84。结论:1、球形孢子丝菌种内遗传多态性较低,本研究提供了一套多态性较高的微卫星标记,将球形孢子丝菌分为三个谱系。2、长春地区种群结构多态性较高;谱系II的遗传多态性最高。3、通过微卫星分子分型显示,球形孢子丝菌遗传多态性与地域分布具有一定相关性,尚未发现三个谱系与临床类型的相关性。4、球形孢子丝菌实时荧光PCR检测方法灵敏度及特异性均为100%,检测下限10fg,能够检测球形孢子丝菌感染组织,阳性率100%。5、多重实时荧光PCR检测方法灵敏度及特异性均为100%,对于球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌检测下限分别为10、10、100 copies,能够对组织中病原菌进行特异性检测,可同时检测混合感染。