前言:银屑病是临床上常见的慢性炎性皮肤病,主要表现为角化细胞的角化过度和角化不全,全球约2%-3%的人群受累。它也被认为是一种全身性疾病,在银屑病及其相关疾病的发生发展及发病机制中,转录因子STAT3发挥重要作用。CCAAT增强子结合蛋白δ（CEBPD）是一种无内含子基因,编码属于CEBP家族的269个氨基酸的蛋白质,一种被认为参与细胞分化,代谢和免疫应答反应的转录因子。Borrelli S.等采用免疫组化法在皮肤恶性肿瘤中进行实验研究,发现CEBPD在基底细胞癌中低表达,而在大多数鳞状细胞癌中表达量较高,这表明CEBPD在角质形成细胞分化的终末期中起重要作用。紫草素是自东方传统植物紫草的提取物,其抗肿瘤作用已被证实近30年。紫草素及其衍生物具有抗血管生成,抗炎和抗糖酵解等作用。刘莉莉等研究表明,IFN-γ刺激HaCaT细胞可以通过STAT3通路促进K17蛋白过度活化,同时紫草素可以在一定程度上通过干扰STAT3来抑制这种效应。徐媛媛等证明,紫草素通过阻断HaCaT细胞中JAK2/STAT3信号通路,降低IL-17诱导的VEGF过表达。我们在之前的研究中发现,CEBPD在银屑病组织中的表达低于正常皮肤组织中的表达。同时,用IL-17和紫草素刺激HaCaT细胞系后,采用PCR芯片技术筛选HaCaT细胞系中JAK/STAT3通路相关基因,筛选出显著的差异基因CEBPD。本研究主要探讨紫草素对角质形成细胞增殖和凋亡的作用机制。我们通过抑制或激活STAT3的表达,证实JAK/STAT3的激活与银屑病CEBPD的下调相关。银屑病有效药物紫草素能有效抑制JAK/STAT3的活化,上调CEBPD的表达,同时抑制银屑病角质形成细胞的增殖和凋亡。材料与方法:1、细胞培养HaCaT细胞系购自Kaiji Biotech Co.,Ltd。将细胞培养于RPMI-1640培养液中,其中含10%胎牛血清（FBS）和1%青链霉素双抗,同时在37℃潮湿培养箱中含5%二氧化碳的环境下培养。采用不同浓度的重组人IL-17A（0,1,10,50,100,200ng/ml）来激活JAK/STAT3通路,不同浓度的Stattic（0,5,10,20,50,100μM）来抑制JAK/STAT3通路。用DMSO将紫草素溶解为20mg/ml作为储存浓度,使用前稀释至相应工作浓度（0,0.5,1,2,4,8,10μM）。同时,对照组细胞在不添加任何药物的完全培养液中培养。2、慢病毒转染在慢病毒转染之前,HaCaT细胞先在不含抗生素的培养液中培养。我们用含有shSTAT3-RNAi（RNAi）或对照组空病毒（NC）的慢病毒对细胞进行转染建立STAT3沉默的HaCaT细胞,为了建立过表达STAT3的HaCaT细胞,我们用含有EGFP-STAT3（LV-STAT3）或对照空载体（vector）的慢病毒进行转染。所有慢病毒均由中国上海吉凯基因公司生产。HaCaT细胞转染于含有Polybrene和感染增强液的培养液中。1.0μg/ml的嘌呤霉素用于筛选成功转染的细胞。倒置荧光显微镜用于观察野生型、STAT3沉默、STAT3过表达及空载体对照组的HaCaT细胞并拍摄照片。3、动物模型6-8周雄性BALB/c小鼠被随机分为5组（n=6）:对照组（CON）、模型组（IMQ）、阳性对照组[0.5mg/kg/d甲氨喋呤（MTX）]、低剂量紫草素组[5mg/kg/d,（SHI5）]和高剂量紫草素组[10mg/kg/d,（SHI10）]。首先将小鼠背部约3.0cmX2.0cm大小区域的皮肤剃毛,并施用5%咪喹莫特乳膏62.5mg,持续10天。对照组涂抹凡士林。各组药物溶解于食用油,以灌胃方式给药。同时将基质（含有5%DMSO的食用油1mg/kg/d）给予对照组和模型组。用数码相机拍摄皮损部位照片。处理后,将动物安乐死,以从病变部位获得皮肤组织样品。4、组织学和免疫组化分析将获得的小鼠皮肤样品用PBS洗涤,用甲醛固定,包埋在石蜡中,并以5μm连续切片。然后进行HE染色,并且在光学显微镜下,对每个样品随机选取6个视野观察以确定平均表皮厚度。免疫组化实验中,样品分别使用兔抗鼠Phospho-Stat3（Tyr705）,anti-STAT3和anti-CEBPD抗体作为一抗,4oC过夜孵育。根据Maixin免疫组织化学试剂盒的说明书进行操作,并染色DAB试剂盒。光镜下随机选取3个中心视野进行染色评估,用Image-Pro 6.0软件计算平均光密度值（MOD）,即积分光密度（IOD）除以相应面积。5、MTS检测采用MTS法测定野生型和过表达STAT3的HaCaT细胞活性,完全按照说明书操作。96孔板中接种3000个细胞/孔,并在37℃且含5%CO₂的潮湿环境中培养。将不同浓度的IL-17A、Stattic、Shikonin分别加入培养液中孵育细胞至24、48、72小时。随后加入MTS避光孵育3小时。通过酶标仪检测490 nm处的吸光度以评估细胞活力。所有数据均来自三次独立重复实验。6、实时定量PCR检测使用miRNeasy Mini Kit从培养的细胞中提取总RNA,并在ND1000分光光度计上测定RNA浓度。按照说明书取1μg总RNA,采用PubMed分别设计STAT3、CEBPD、GAPDH引物。在7900HT快速实时PCR系统中进行扩增反应。扩增过程如下:95℃×2分钟,95℃×15秒40个循环和60℃×1分钟,并产生熔解曲线以确认特异性。采用2^-ΔΔCt法进行数据分析,GAPDH基因作为对照。所有数据均来自三次独立重复实验。7、免疫印迹按照说明书操作,用含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从培养的细胞和小鼠皮肤组织样本中提取总蛋白。蛋白质浓度由BCA蛋白测定试剂盒来测定。等量的总蛋白（20μg的细胞样本或30μg的组织样本）通过浓度10%SDS凝胶电泳,随后转印到PVDF膜上。在含5%脱脂牛奶或BSA的TBST中封闭1 h,然后在4℃下在相应的一抗中孵育过夜,然后与山羊抗兔二抗一起孵育1小时。用ECL试剂盒在化学发光成像系统上进行显色。8、流式细胞术HaCaT细胞以2x10⁵个/孔的密度接种于6孔板中,培养24h。细胞周期分析实验,细胞需先在无血清培养基中孵育24h,实现同步化,然后,将其转移到含有不同浓度紫草素的正常培养液中再培养12h。然后,细胞被消化、收集,固定于75%冷乙醇4℃过夜,随后用含5μlRNase A（5mg/ml）的500μl缓冲液37℃水浴30分钟分解RNA,然后添加5μlPI（5mg/ml）避光冰浴30分钟进行染色。细胞凋亡实验中,收集后的HaCaT细胞在含有5μlAPC偶联Annexin V和5μlPI（5μg/ml）的500μl缓冲液中避光染色30分钟。采用BD LSRFortessa设门取10000个细胞进行分析。ModFit软件分析细胞周期分布。9、统计学分析数据表示为平均值±标准偏差（SEM）。比较两组数据时,使用t检验;单因素方差分析用于比较两组以上数据。SPSS 21.0用于所有统计分析,P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1、HaCaT细胞系JAK/STAT3通路的激活引起CEBPD表达下降MTS结果表明,HaCaT细胞经IL-17A处理后,增殖活性显著高于对照组,并且具有时间和浓度依赖性,Stattic处理的HaCaT细胞显示出相反的趋势。RT-qPCR结果显示IL-17A（10ng/ml）对JAK/STAT3通路的激活具有时间依赖性,在6h达到峰值,而CEBPD则下调。Stattic（2.5μm）处理后的HaCaT细胞,JAK/STAT3通路被抑制,而CEBPD上调。同时,免疫印迹结果显示,JAK/STAT3被IL-17A（10 ng/ml）显著激活,CEBPD表达略升高;而在Stattic（2.5μM）作用下,CEBPD升高明显,与JAK/STAT3通路抑制程度相对应。然后用含有shSTAT3-RNAi（RNAi）的慢病毒转染沉默STAT3基因,之后IL-17A处理细胞24h。RT-qPCR和免疫印迹结果显示,shSTAT3-RNAi显著下调STAT3基因,CEBPD略有上调;此外,加入IL-17A后这些蛋白未见明显变化。这些结果表明JAK/STAT3途径的激活在CEBPD的下调中起作用,而JAK/STAT3抑制显著上调CEBPD。2、慢病毒转染成功建立STAT3过表达的HaCaT细胞模型按上述方法转染HaCaT细胞后荧光显微镜观察转染EGFP-STAT3（LV-STAT3）或对照空载体（Vector）的慢病毒感染细胞,见荧光表达约达到90%。随后采用RT-qPCR和WB检测HaCaT细胞中STAT3的含量,LV-STAT3组细胞中STAT3mRNA和蛋白含量明显升高。3、紫草素通过上调CEBPD显著抑制HaCaT细胞增殖并诱导细胞凋亡MTS测定的结果显示,紫草素以时间和剂量依赖性方式显著抑制野生型和LV-STAT3组中HaCaT细胞的增殖。流式细胞术分析进一步证实了细胞周期分布和细胞凋亡的变化:紫草素显著增加野生型和LV-STAT3组中HaCaT细胞的凋亡率,LV-STAT3组HaCaT细胞对紫草素的作用更敏感（P<0.05）;且紫草素明显阻滞HaCaT细胞周期于G0/G1期。同时,我们用免疫印迹法检测细胞周期相关蛋白cyclin E和凋亡相关蛋白cleaved-caspase 9,结果与流式细胞术分析一致。同时,WB结果显示紫草素明显抑制STAT3蛋白表达并上调CEBPD表达。4、紫草素通过上调CEBPD减轻咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型病变咪喹莫特非常显著的在小鼠背部皮肤上引起了类似银屑病的症状,同时紫草素可明显减轻鳞屑、表皮增生等症状。HE染色结果显示,施用咪喹莫特后,小鼠皮肤角质形成细胞增生明显,紫草素组表皮厚度较模型组（IMQ）薄,尤其是大剂量紫草素组（SHI10）。免疫组化和免疫印迹法结果显示,模型组的JAK/STAT3信号通路被明显激活,而CEBPD含量下降,紫草素可以逆转STAT3和CEBPD的蛋白表达水平。结论:1、紫草素通过抑制角质形成细胞的增殖和诱导细胞凋亡,起到治疗银屑病的效果,该过程与JAK/STAT3通路相关。2、JAK/STAT3途径的激活诱导HaCaT细胞和咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中CEBPD蛋白表达的下调。3、紫草素可以逆转JAK/STAT3活化的作用,提示CEBPD可能是银屑病潜在的治疗靶点。