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背景:家族性高胆固醇血症(Familial hypercholesterolemia,FH,OMIM#143890)是一种常见且严重的常染色体显性单基因遗传性疾病,以血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇明显升高、皮肤黄色瘤、早发冠心病为主要特征。FH是一种遗传异质性很高的疾病,基于家系样本的致病基因定位策略已发现13个基因与胆固醇代谢紊乱有关,包括LDLR、apoB-100、PCSK9、ABCG5和ABCG8等。传统的研究认为,FH主要的发病机制是致病基因蛋白质编码区的相关突变引起蛋白结构或功能改变,如LDLR基因突变,引起细胞膜表面的LDLR缺如或结构功能异常,导致全身组织对血循环低密度脂蛋白利用障碍并在组织内过度淤积。近年来的研究提示,蛋白质编码区的相关突变并不能说明FH全部的发病原因。因此,需要更深入的研究。RNA剪接(RNA splicing)是真核生物转录过程中的一个重要步骤,它将基因序列中的非编码部分(内含子)从序列中剪除,将编码部分(外显子)连接起来得到前体m RNA。异常剪接也会引起蛋白质的结构和功能改变,是疾病发生的一个常见原因。有相当一部分突变位于非蛋白质编码区的内含子区域,可能通过影响剪接模式而导致疾病的发生。目前推测,在单基因遗传病中,大约1/3的变异会引起mRNA的异常剪接。因此,异常剪接是单基因遗传病另一个重要的发病机制,需要一个系统的方案对异常剪接进行筛查。RNA剪接广泛存在于真核生物中,面对巨大而复杂的基因组数据,仅利用传统的实验方法还不能满足剪接位点的研究需要,这就迫切要求一种能精确计算预测剪接位点的生物信息学方法来指导实验的顺利进行。常用的剪接位点的预测方法有MaxEntScan,NNSPLICE和Net Gene2等。但是,这些方法对预测结果的解释还没有达成共识,对于剪接位点评分解释一致的截止值尚未确定,此外,对分析的序列长度有一定限制。本研究采用gkm-SVM方法对FH致病基因的剪接突变进行筛查,评估这些突变是否会影响剪接。通过生物信息学理论方法筛查FH相关致病基因的剪接突变,将大大缩小实验范围,为探索剪接机制提供了指导方向。目的:1.建立基于gkm-SVM剪接突变预测的方案。2.系统的筛查FH相关剪接突变。3.在细胞水平验证剪接突变对FH发生的作用。方法:1.从HS3D数据库中获得真实剪接位点和虚假剪接位点序列,按照一定的长度截取序列组成新的数据集。利用正集训练集和负集训练集对gkm-SVM模型进行训练。利用测试集数据来检验所建模型的正确性。从HGMD专业数据库获得78个致病的剪接突变,从ClinVar和1000基因组获得53个良性多态性,用于评估gkm-SVM方法对剪接突变的预测效果,并与其它方法进行比较。2.使用R语言中一个名为Shiny的R包,基于Shiny框架建立用户可视化界面,方便用户对剪接突变进行预测。3.针对已有FH致病基因的突变筛查在剪接位点附近的剪接突变,利用gkm-SVM模型对FH相关剪接突变进行预测。4.采用minigene技术对FH相关剪接突变进行功能验证:构建ABCG5基因的一个突变点IVS7+2 G>A野生型和突变型质粒,转染HepG2细胞,并提取细胞总RNA,进行RT-PCR分析和测序。通过RT-PCR产物的电泳条带以及测序鉴别其剪接结果。结果:1.建立了gkm-SVM剪接突变预测模型,对于供体位点,正样本识别率和负数样本识别率分别达95.9%和89.9%,相关系数为0.8286;对于受体位点,正样本识别率和负数样本识别率分别达86.6%和82.7%,相关系数为0.6653,说明gkm-SVM模型达到了较高的敏感性和特异性。对所建立的gkm-SVM模型进行评估,ROC曲线分析结果表明无论是供体位点还是受体位点,gkm-SVM方法都表现出了较好的预测性能。2.基于Shiny框架成功建立了预测剪接突变的可视化界面,方便用户对感兴趣的剪接突变进行分析,评估突变对剪接的是否会产生影响。3.筛查FH相关剪接突变:筛选出LDLR基因剪接突变有108种,其它FH相关基因(apoB-100、PCSK9、ABCG5和ABCG8)的剪接突变总共有14种。4.琼脂糖凝胶电泳结果显示,野生型质粒所得的RT-PCR产物正常,条带大小为295bp,而突变型没有正常条带,取而代之的是81bp的条带。经测序后证实突变型的目的条带为81bp,成熟mRNA将整个外显子8剪切掉,造成突变型质粒所得的RT-PCR产物缩短。结论:1.本研究建立的gkm-SVM模型达到了较高的灵敏性和特异性。无论是供体位点还是受体位点,gkm-SVM与其它方法比较都表现出了较好的预测性能。2.根据gkm-SVM的预测方案,对于供体位点,84.1%的LDLR剪接突变可能对剪接造成影响,对于受体位点,86.7%的LDLR剪接突变可能对剪接造成影响。3.采用minigene技术,验证了ABCG5基因突变点IVS7+2 G>A确实发生异常剪接,致使外显子8缺失,进而导致蛋白质结构和功能异常。