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内切葡聚糖酶是纤维素酶的一种,主要作用于纤维素的非结晶区域,通过随机切断p-1,4-糖苷键,从而降解纤维素形成纤维寡糖、纤维三糖等短链低聚糖。内切葡聚糖酶的活力大小直接影响纤维素的降解效率,其在工业生产生物乙醇和纸浆处理中应用广泛,具有良好的应用前景。目前,如何提高内切葡聚糖酶活力及产量已成为了研究的一大热点。本文出发菌株为匍枝根霉TP-02,具有典型纤维素酶活力,是由本实验室从腐木内筛选得到的。本文在此基础上,获取其内切葡聚糖酶基因并进行修饰,对酶的结构功能进行了研究,成功构建工程菌以提高酶活力。主要研究成果如下：1)成功合成了匍枝根霉cDNA单链,并从中克隆到一个新内切葡聚糖酶基因eg2,上传至GenBank获取登录号JX315341。将其连接pET28a载体,转化大肠杆菌BL21,并采用CMC-Na筛选培养基获得阳性克隆。对该重组菌进行发酵实验,发现其在IPTG诱导下,发酵21h后,内切葡聚糖酶酶活力达到峰值0.723IU/mL。2)利用生物信息学软件对eg2基因结构功能进行预测和分析。该基因长954bp,编码317个氨基酸,其基因产物EGⅡ含一个典型的真菌纤维素结合区域即CBM1,及两个催化结构域即GH45特征序列,归属于糖苷水解酶第45家族。其N末端23个氨基酸残基为标准信号肽序列,理论上为可溶性较好的球蛋白。3)分别对CBM1和GH45序列进行比对分析及结构模拟,确定基因修饰位点如下：N39S, V136D, T251G, D255G, P256S和E260D。着眼于EGⅡ的催化机理,初步探讨其催化区GH45的结构与功能关系。通过模拟突变,利用Discovery Studio软件模拟分子对接,分析底物与突变前后GH45区的结合模式,发现突变前的催化中心呈凹槽型,底物与其表面极性基团作用,受力不均,不能有效降解；突变形成后,随着loop环的打开,组成了一个隧道型活性区域,使底物能快速准确进入其中,并与隧道内极性基团作用,持续降解释放出寡糖,避免了底物堆积的形成。4)设计突变组,并利用重叠PCR进行定点突变,成功筛选出12株大肠杆菌重组菌,完成对EGⅡ的分子改造。发酵实验结果显示各突变株的酶活均比原始菌株高,其中,EGII-E(含以上6个突变位点)在发酵21h后达到峰值1.321IU/mL,比EG II的原始酶活提高了82.7%。此外,突变株的发酵特性显示,催化残基V136D和E260D的突变形成对酶活有显著提高；N39S提高了CBM1的结合能力,同时缩短了达到峰值的时间；loop环的突变无法单独发挥作用,只对催化过程起辅助作用。5)将以上构建的重组菌经IPTG诱导21h后,以未诱导的重组菌和诱导的空载为对照,进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果显示,EGⅡ的分子量为45kDa。其中,突变株EGⅡ-E的表达条带最粗,表达量较高。6)将eg2基因连接pPIC9K质粒,成功实现其在毕赤酵母GS115中的表达。利用MD平板和CMC刚果红平板筛选得到阳性克隆,对其进行发酵培养,经甲醇诱导培养84h后,酶活达1.754IU/mL,是其大肠杆菌重组菌的2.43倍。