论文部分内容阅读
背景糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病患者在长期高血糖损害引起神经元功能障碍引发的一组异质性疾病,常表现为远端对称多发性伴疼痛的糖尿病神经病(Painful diabetic neuropathy,PDN),患者常感觉到肢体麻木、蚁行感、烧灼感,严重影响患者的生活质量。由于其发病机制尚未完全阐明,因此常常缺乏行之有效的治疗方法。达格列净(dapagliflozin)属于新型降糖药物,由于其不依赖于胰岛素分泌的降糖机制而受到关注。达格列净主要通过抑制肾脏近端肾小管重吸收尿液葡萄糖的SGLT-2蛋白使肾糖阈降低,从而排出多余的葡萄糖,达到降低血液循环中葡萄糖水平的目的。除了降糖之外,达格列净通过影响血糖、血脂、体重等因素兼具改善血脂、减轻体重等额外作用。其降低体重改善血脂代谢的作用主要与其减少了尿葡萄糖的重吸收导致能量的丢失有关,相当于一定程度的能量限制。有研究表明能量限制可以保护神经细胞,治疗神经损伤性疾病,如癫痫、老年痴呆、脊髓创伤等。那么达格列净缓解糖尿病神经痛除了降血糖的关系,是否有神经保护作用可以直接作用于神经系统以及其分子机制是本实验的科学问题。目的本实验使用PDN大鼠模型,并给PDN大鼠使用新型降糖药达格列净后观察其行为学变化,检测达格列净对糖尿病周围神经痛大鼠的镇痛作用;检测达格列净治疗后大鼠周围神经节内组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase2,HDAC2)的变化以及钾离子通道(Voltage gated potassium ion channel 1.2,Kv1.2)的表达变化;探索达格列净保护神经细胞镇痛的相关分子机制。方法1.腹腔注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)建立糖尿病大鼠模型,检测术后D3、D7、D14随机血糖,检测大鼠机械痛、冷痛、热痛阈值并筛选出PDN大鼠。2.将大鼠分为五组:当术后D14大鼠机械痛阈值下降50%时,将大鼠分为naive组,PDN+vehicle组,PDN+1mg/kg dapagliflozin组,PDN+5mg/kg dapagliflozin组,PDN+10mg/kg dapagliflozin组,并给予达格列净治疗组连续治疗14天,分别测量三组大鼠药物治疗后的空腹血糖及用药D3、D7、D14的机械缩足阈值、热缩足潜伏期、冷缩足潜伏期的变化情况。3.达格列净治疗后D14,使用检测大鼠β-HB的ELISA试剂盒,评估三组大鼠血清β-HB的水平。4.免疫荧光和Western-blot检测达格列净治疗后大鼠脊神经节(dorsal root ganglion,DRG)组织中Kv1.2、HDAC2蛋白表达水平的改变。5.PDN大鼠于STZ注射后D14疼痛明显时,将大鼠分为分为naive组,PDN+vehicle组,PDN+romidepsin组,给予PDN+romidepsin组大鼠腹腔注射HDAC2特异性抑制剂romidepsin两周,并在romidepsin注射后D3、D7、D14检测三组大鼠行为学变化。6.PDN大鼠注射HDAC2特异性抑制剂romidepsin两周后,取三组大鼠DRG组织,做Western-blot实验检测三组大鼠Kv1.2蛋白的表达变化。7.制作坐骨神经慢性压榨痛大鼠模型,将大鼠分为naive组,CCI+vehicle组,CCI+1mg/kg dapagliflozin组,CCI+5mg/kg dapagliflozin组CCI+10mg/kg dapagliflozin组,术后D2给予达格列净治疗两周,并于用药后D3、D7、D10、D14观察对痛阈值的影响。8.CCI神经病理性疼痛大鼠给予达格列净治疗两周后取DRG组织做Western-blot实验,观察达格列净对HDAC2的影响。9.嗜铬瘤细胞(PC12)培养,将细胞分为两组,一组用正常培养基培养,一组在培养基中加入组蛋白去乙酰化酶内源性抑制剂β-羟丁酸(βhydroxybutyric acid,β-HB),使其浓度成为含β-HB为0.6mmol/L的培养基,培养24h后,收集细胞做Western-blot实验,检测Kv1.2、HDAC2的蛋白表达;评估β-HB在细胞水平对HDAC2的调控作用,以及对Kv1.2的翻转作用。结果1.糖尿病大鼠与空白对照组大鼠相比,其血糖在STZ术后D3升高显著(***p<0.001),D3后每周测定血糖均保持稳定升高,提示糖尿病大鼠建模成功;STZ术后D14,70%糖尿病大鼠机械痛阈显著下降(***p<0.001)。空白对照组大鼠痛阈值稳定在正常水平,证明PDN模型建造成功。2.达格列净治疗后D3、D7、D14,测量血糖及机械缩足阈值、热缩足阈值、冷缩足阈值的变化。结果显示:PDN大鼠使用达格列净后血糖下降,用药后D7出现冷痛阈和机械痛阈回升。与vehicle组大鼠相比,达格列净组大鼠用药D7和D14后,机械痛阈和冷痛域有所回升(#p<0.05),用药D3后热痛有所回升(&p<0.05),vehicle组大鼠疼痛状态未改善。3.使用ELISA试剂盒检测三组大鼠血清中β-HB水平,结果显示,与vehicle组的PDN大鼠相比,达格列净治疗组的PDN大鼠β-HB水平有所上升(***p<0.001)。4.上述大鼠于达格列净用药后D14取材(即STZ注射后D28),利用Western-blot技术检测HDAC2和Kv1.2的蛋白表达情况,结果显示,与na?ve组大鼠相比,vehicle组PDN大鼠L4-L6的DRG组织中Kv1.2蛋白水平明显降低(**p<0.01),HDAC2蛋白水平明显升高(***p<0.001)。与使用安慰剂的PDN大鼠相比,使用高剂量达格列净的PDN大鼠的Kv1.2蛋白表达回升(#p<0.05),HDAC2下降(##p<0.01)。5.免疫荧光检测达格列净治疗后大鼠Kv1.2和HDAC2在DRG神经元的表达水平,结果显示与naive组相比,糖尿病周围神经痛大鼠L4-L6的DRG组织中Kv1.2蛋白的平均荧光强度明显降低(***p<0.001),HDAC2蛋白的平均荧光强度明显升高(***p<0.001)。与vehicle组PDN大鼠相比,达格列净组PDN大鼠Kv1.2蛋白平均荧光强度回升(###p<0.001),HDAC2蛋白平均荧光强度下降(###p<0.001)。6.PDN大鼠使用HDAC2特异性抑制剂romidepsin,检测行为学变化,结果显示:与注射vehicle组的PDN大鼠相比,romidepsin组PDN大鼠使用抑制剂后D7大鼠机械痛敏和冷痛敏显著缓解(###p<0.001),大鼠热痛敏较vehicle组大鼠有所缓解(#p<0.05)。7.PDN大鼠注射romidepsin两周后取DRG组织,做Western blot实验,结果显示:与vehicle组PDN大鼠相比,romidepsin组PDN大鼠Kv1.2蛋白表达回升(##p<0.01)。8.CCI神经病理性疼痛大鼠使用中高剂量达格列净治疗后,与vehicle+CCI组大鼠相比,中高剂量dapagliflozin+CCI组大鼠机械痛(#p<0.05)、热痛(#p<0.05)有所缓解。9.CCI神经病理性疼痛大鼠使用达格列净治疗后,与CCI+vehicle组大鼠相比,达格列净治疗组CCI大鼠L4-L6的DRG中HDAC2表达有所下降(#p<0.05)。10.收集细胞做Western-blot实验,结果显示与正常DMEM培养基组的细胞相比,培养基中加入β-HB组的细胞,Kv1.2蛋白表达水平上升,HDAC2蛋白表达水平下降(*p<0.05)。结论达格列净可以缓解糖尿病神经痛和CCI大鼠神经病理性疼痛,其镇痛机制可能是通过增加体内酮体β-HB的含量,抑制去乙酰化酶HDAC2的表达,从而翻转Kv1.2的低表达,降低神经元的兴奋性,缓解疼痛。