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研究背景和目的:炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一种病因尚不明确的主要累及胃肠道的慢性非特异性炎症性疾病,包括克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)。临床表现主要为腹痛、腹泻及粘液脓血便,具有发作与缓解交替发生的特点。对于IBD发病原因及发病机制的探讨一直是消化系临床医师和科研工作者研究的热点和难点问题。IBD发病机制虽然还不明确,目前世界范围普遍接受的观点为,IBD是具有遗传易感性的个体在应对某些药物、周围环境及肠道微生态变化而产生的失调的免疫反应。人类白细胞免疫球蛋白样受体活化性受体成员3(Leukocyte Immunoglobulin Like Receptor A3,LILRA3),又称为 ILT-6 或 CD85e,是人类白细胞免疫球蛋白受体家族(Leukocyte Immunoglobulin Like Receptors,LILRs)中的一员。目前国内外关于LILRA3的研究为数不多,已有研究报道其基因多态性同人类多种自身免疫性疾病发病相关,如系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)、类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)、多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)及淋巴瘤等,且LILRA3在多种自身免疫性疾病患者中表达增高,这些研究提示LILRA3在自身免疫性疾病及人体免疫反应中发挥重要作用。目前国内关于LILRA3的研究几近空白,鉴于在IBD发病及疾病进展过程中,自身免疫因素发挥了至关重要的作用,由此我们推测LILRA3可能参与IBD的发病。为此本研究我们初步探讨了 LILRA3同IBD发病的关系。方法:收集2014年9月到2016年1月在武汉大学中南医院消化内科住院治疗且明确诊断的CD患者185例、UC患者193例及同期在中南医院体检中心体检的健康对照者509例。对纳入的研究者收集外周血1ml并详细记录纳入者的基本信息和临床资料。提取全血基因组DNA,采用PCR-LDR(Polymerase Chain Reaction-Ligation Detection Reaction)方法测定LILRA3基因下述位点基因多态性:6.7kb片段缺失、rs103294及rs410852。分析基因型和等位基因型同CD及UC发病的关系,分析基因型及等位基因型同CD及UC各临床表型之间的关系。利用实时定量 PCR(quantitative Real Time PCR,qRT-PCR)技术检测 LILRA3mRNA表达情况,并根据样本基因型信息对样本进行分组,进一步研究各位点基因多态性对LILRA3 mRNA表达量的影响。招募于中南医院内镜中心行电子结肠镜检查的IBD患者,肠道息肉或肠道新生物患者(即非IBD患者,NIBD)并收集IBD患者结肠炎症部位肠黏膜,NIBD患者正常结肠黏膜,采用免疫组织化学方法研究LILRA3在肠黏膜中的表达定位及在各组黏膜中的表达量。采用qRT-PCR方法研究LILRA3在各组肠黏膜标本中的表达情况。提取IBD患者及NIBD对照者肠黏膜中的总蛋白,利用western-blotting方法研究LILRA3在各组肠黏膜中的蛋白表达情况。利用慢病毒转染方法构建LILRA3过表达U937细胞系及空载体U937细胞系,采用qRT-PCR方法研究LILRA3过表达后U937细胞主要细胞因子及趋化因子、趋化因子受体等的表达情况;利用Transwell方法研究LILRA3过表达细胞株迁移功能的改变;采用流式细胞术方法研究LILRA3对细胞凋亡和细胞吞噬功能的影响;采用CCK8方法研究LILRA3对U937细胞细胞增殖能力的影响;采用western-blotting方法进一步研究LILRA3发挥上述作用的可能分子机制。结果:6.7kb缺失及rs410852无论在基因型水平还是等位基因水平同CD及UC发病均无相关性(P>0.05)。rs103294在基因型水平同CD及UC发病均不相关,但是在等位基因水平,其等位基因频率在CD患者与健康对照者中的分布有显著统计学差异(P=0.04,OR=1.32,95%CI=1.01-1.73),但在UC患者与健康对照者中的分布没有统计学差异(P=0.78)。6.7kb及rs103294基因型同CD及UC各临床表型之间没有相关性(P>0.05);含有rs410852突变基因型(GG,AG)的CD患者同野生型患者(AA)相比发生肠道狭窄和穿孔的风险降低,且差异具有统计学意义(狭窄,P=0.03,OR=0.23,95%CI=0.07-0.75;穿孔,P=0.04,OR=0.20,95%CI=0.05-0.74),rs410852基因型同UC各临床表型之间无相关性。6.7kb片段缺失能够影响LILRA3 mRNA表达,具体表现为纯合子缺失个体(-/-)LILRA3mRNA表达极少,几乎测不出,杂合子缺失(-/+)和野生型个体(+/+)LILRA3 mRNA表达量均明显增高。将三组中纯合子缺失个体剔除后重新统计发现CD及UC组LILRA3 mRNA表达量较健康对照组相比显著升高(CD vs.HC,P<0.01;UC vs.HC,P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示LILRA3定位在黏膜固有层细胞的细胞胞浆中,提示LILRA3是一种可溶性的蛋白,这与国外研究结果是一致的,我们研究还发现在CD及UC患者结肠黏膜标本中LILRA3阳性细胞数均明显高于非IBD组结肠标本(CDvs.NIBD,P<0.01;UCvs.NIBD,P<0.05)。成功构建LILRA3过表达U937细胞株后进一步研究发现,(1)LILRA3能够抑制U937细胞分泌细胞因子干扰素γ(Interferon Gamma,IFN-γ)、肿瘤坏死因子 α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)及白细胞介素 6(Interleukin-6,IL-6);(2)LILRA3能够减少U937细胞趋化因子的分泌,减少其细胞膜表面上趋化因子受体的数量从而减弱U937细胞的趋化迁移能力;(3)LILRA3能够增加细胞胞膜上清道夫受体的数量从而上调U937细胞吞噬荧光微球的能力;(4)LILRA3可以同时激活细胞内AKT和MEK通路调控U937细胞增殖;(5)LILRA3对U937细胞凋亡没有影响。结论:(1)LILRA3基因是中国IBD人群的易感基因,虽然我们研究结果提示其基因型与IBD的临床表型有关联,但仍需要在其他人口及更大样本人群中进行验证。(2)6.7kb缺失同IBD发病无明显相关性,但能影响LILRA3 mRNA水平的表达。(3)LILRA3 mRNA和蛋白表达水平在IBD患者外周血及肠黏膜标本中均显著增高(CD患者升高尤为显著),且IBD患者肠黏膜LILRA3阳性细胞数较对照组相比亦明显增多,这些新发现为今后LILRA3成为IBD尤其是CD治疗的潜在靶点提供了重要的理论依据。(4)LILRA3能够抑制U937细胞分泌某些细胞因子,如IFN-γ、TNF-α和IL-6等。(5)LILRA3能够减少U937细胞分泌趋化因子,减少U937细胞胞膜上趋化因子受体的数量从而减弱U937细胞的迁移能力。(6)上调LILRA3的表达对U937细胞凋亡没有影响。(7)上调LILRA3的表达能够增加U937细胞胞膜上清道夫受体的数量,从而促进单核细胞的吞噬功能。(8)LILRA3可能通过共同激活细胞内AKT和MEK信号通路调控U937细胞的增殖能力。