论文部分内容阅读
鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus, SVCV)属于弹状病毒科水泡性病毒属中的一员,该病毒可引起鲤鱼爆发鲤春病毒血症(Spring Viremia of Carp,SVC)。囊膜糖蛋白(G)是SVCV最主要的免疫原性蛋白,是疫苗和诊断试剂研制的重要靶蛋白。本研究将连有SVCV G蛋白(SVCV/G)基因的重组转移质粒pFastBac-SVCV/G转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-SVCV/G。在脂质体介导下将该重组子转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Bac-SVCV/G。结果发现SVCV/G可介导昆虫细胞发生融合,通过间接免疫荧光证明,SVCV/G蛋白表达在昆虫细胞膜上。前人研究发现,水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)的G蛋白(VSV/G)同样可以表达在昆虫细胞膜上并可介导昆虫细胞融合。为比较SVCV/G与VSV/G介导的细胞融合,以及便于杆状病毒滴度的测定,本研究构建了三个重组杆状病毒Bac-SVCV/G-CMV-EGFP、Bac-VSV/G-CMV-EGFP、Bac-CMV-EGFP,并用间接免疫荧光和Western blot检测了SVCV/G的表达。通过比较SVCV/G与VSV/G介导的昆虫细胞融合,证实了SVCV/G可介导更加显著的细胞融合。杆状病毒能高效转导哺乳动物细胞,现已成为一种新型的基因导入载体。本研究利用含有巨细胞病毒极早期基因(Cytomegalovirus immediate-early, CMV-IE)启动子及其下游增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)报告基因的重组杆状病毒Bac-CMV-EGFP,分别转导了6种鱼类细胞系,并利用流式细胞仪检测了重组杆状病毒对鱼类细胞系的转导效率。研究发现,该重组杆状病毒可以高效转导鱼类细胞,特别是鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞和胖头鲤肌肉(FHM)细胞,转导效率几乎为100%,对大马哈鱼胚胎细胞(CHSE-214)细胞的转导效率较高,其次是草鱼肾脏(CIK)细胞和斑点叉尾鲴卵巢(CCO)细胞,对虹鳟性腺(RTG-2)细胞的转导效率虽不高,但发现也可以被转导。同时,本研究还发现,报告基因在EPC细胞中的表达能够持续存在至少80天,说明杆状病毒转导EPC细胞后,不仅可以实现外源基因的高效导入,而且还可以使外源基因稳定、高量的表达。此外,本研究还发现以生长培养基作为杆状病毒孵育液比以PBS作为孵育液能够更有效的提高转导效率。