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遗传重组是生物进化最主要的驱动力之一。生物通过遗传重组插入、删除或重排功能基因及对应性状,修复各种因素导致的DNA损伤,维持遗传物质正常的复制及分离,实现遗传信息的动态稳定。重组中间体Holliday junction（HJ）的拆分是DNA重组的关键步骤,参与这一过程的酶称为拆分酶（resolvase,亦称为解析酶）。拆分酶本质上是核酸酶,它们广泛存在于病毒、原核生物和真核生物,已发现的拆分酶都以二聚体形式存在,它们能特异识别重组中间体HJ结构,并在分枝点附近同时引入两个切刻位点,将四链交叉结构拆分成两条切刻双链DNA。T7 Endonuclease I （T7EI）由T7噬菌体gene3编码,是研究较为透彻的拆分酶。该酶不仅被作为拆分酶拆分机制研究的模型,也被作为蛋白质淀粉样沉淀研究的工具。蓝细菌是叶绿体起源的基础,能进行光合作用和生物固氮,是海洋表面分布最广的原初产物制造者。近年来蓝细菌及其噬菌体基因组学研究的开展不仅为蓝细菌及其噬菌体的共进化提供了证据,由于物种起源于原始海洋,蓝细菌及其噬菌体的研究也成为研究生物内各种机制进化的新素材,成为基因工程工具酶发现的新领域。本论文以T7EI及其在蓝细菌噬菌体中的同源蛋白P-SSP7 Endonuclease I（P-SSP7EI）和Syn5 Endonuclease I（Syn5EI）为对象,对T7EI的二聚化过程和蓝细菌拆分酶的催化特性进行了系统研究,主要内容如下:1.为研究T7EI的二聚化模式和不同二聚体的结合强度,人工设计并纯化获得了一系列具有单个活性结构域的异源二聚体,并建立了基于亲和层析的二聚体结合强度分析方法。结果表明,获得的异源二聚体具有切刻核酸酶的活性,并能与Holliday junction特异结合。逐级变性洗脱测定结合强度和竞争性复性实验结果显示,结合强度越高的二聚体,在竞争性复性中二聚化的几率越高;而且发生在β-bridge上的突变会显著影响二聚体的结合强度和结合效率。根据上述结果提出了关于T7EI二聚化的一种新假说:即在T7EI二聚化过程中,首先是β-bridge的结合,然后在此基础上进一步折叠形成两个活性结构域。该假说不仅可以解释上述实验结果,也可以解释在正常生理条件下T7EI为什么以二聚体形式存在,而不会导致淀粉样沉淀的形成。2.蓝细菌噬菌体P-SSP7 gene3编码一种与T7EI同源的核酸酶（116个氨基酸残基）,与T7EI（149个氨基酸残基）相比,P-SSP7EI缺少N-端13个氨基酸残基和C-端18个氨基酸残基,而且在β-bridge上缺少了3个氨基酸残基P47A48S49。在T7EI中C-端序列的缺失会导致其失活,β-bridge上的变异会严重影响酶的催化特性。本研究合成了P-SSP7 gene3,并通过MBP和His-Tag融合表达系统表达纯化获得纯的P-SSP7EI,并对其催化特点进行了系统研究。研究结果表明:（1）P-SSP7EI可特异识别并切割具有十字交叉（cruciform）结构的pUC（AT）质粒及人工合成的Hollidayjunction底物Junction3,切割位点位于交叉点上游5′端。其与Junction3的结合能力是线性DNA的1000倍,解离常数为10nM。（2）在Mg2+存在时,P-SSP7EI可随机切刻线性DNA两条链中的一条链,而在Mn2+存在时,P-SSP7EI不仅具有随机切刻（Random-Nick）线性DNA活性,而且具有切刻位点特异切割（Count-Nick）活性,该活性作用于切刻位点互补链5′端3～4核苷酸处。（3）在Mn2+存在时,P-SSP7EI具备良好的错配切割能力,能够识别所有类别的单碱基错配,而在Mg2+存在时识别和切割单碱基错配的能力明显下降。（4）点突变证明,Glu7、Asp39、Glu49、Lys51位于酶的活性中心,在β-bridge上添加3个氨基酸残基（与T7EI相比缺失的3个氨基酸残基）会导致P-SSP7EI失活,为P-SSP7EI添加T7EI的C-tail对其活性无明显影响。（5）P-SSP7EI热稳定性较差,Mn2+可显著提高其热稳定性。3.蓝细菌噬菌体Syn5 gene22编码产物与P-SSP7EI和T7EI相似度分别为46%和44%,与P-SSP7EI类似,Syn5EI缺失了T7EI N-端11个氨基酸残基、C-端17个氨基酸残基和位于β-bridge上的三个氨基酸残基P47A48S49。本研究合成了Syn5 gene22,利用MBP和His-Tag融合表达系统获得纯的Syn5EI,并对其酶学性质进行了系统分析。结果证明Syn5EI也具有拆分酶活力,其拆分酶活力与T7EI更接近,而与P-SSP7EI不同。Syn5EI的随机切刻活力和Count-Nick活力与P-SSP7EI类似,在Mg2+存在时具备随机切刻线性DNA的活性,而在Mn2+存在条件下同时具备两种活性。4.系统分析了噬菌体核酸酶Ⅰ家族的序列特征,分析了其序列及结构特征的演化,发现宿主生存环境与其进化关系密切。首次表达并分析T7EI的远源同源蛋白phiv10-p45的生物学活性,证明该酶不具有拆分酶活性,具有随机切刻活性。phiv10-p45属于包含PD……（E/D）XK模体的功能未知蛋白家族Pfam06356,本研究首次为其提供了功能注解。本研究设计并获得具有单个活性结构域的杂合T7EI,并对不同T7EI杂合体的结合强度及二聚体效率进行了分析,提出了一种T7EI二聚化机制的模型。该结果对于分子设计、蛋白质二聚化理论和蛋白质淀粉样沉淀研究具有一定参考价值。首次克隆、表达、纯化到两种来源于蓝细菌噬菌体的拆分酶P-SSP7EI和Syn5EI,并对其酶学特征进行了系统研究,该研究不仅拓展了拆分酶的研究领域,为拆分酶的催化机制提供新证据,并可作为潜在的基因工程工具酶应用于科学研究和生产实践。