背景及目的早产儿(preterm infant)定义为胎龄小于37周出生的新生儿。由于宫内营养储备不足、早期生活能力差、出生以后存在各种合并症、外界环境因素的各种不良影响、营养摄入不足,而导致其出生后生长发育进一步延迟。许多患儿在出院时存在累积营养不足及随之而来的生长受限,即宫外生长受限(extrauterinegrowth restriction,EUGR)。宫外生长受限(EUGR)指出生后生长发育计量指标低于预期的10%宫内生长率水平(<10%生长曲线),主要评价指标包括体重、身长和头围。早产儿的EUGR发生率极高,早产儿的EUGR发生率可达60%,问题十分突出。这已成为早产儿研究领域的一个新热点。生命早期营养环境与成年期发生的肺动脉高压或肺血管异常等心血管疾病的风险密切相关。这种现象可能与个体代谢和器官结构的适应性调节有关,以适应早期生活中的营养不良环境。生命早期不良环境因素,特别是营养环境,不仅与个体的早期发育有关,而且对成人的健康和生活质量也有长期甚至终身的影响。这种由早期生活环境(包括宫内和宫外环境)变化引起的持续适应性变化也称为发育编程或发育可塑性。前期研究发现,宫外生长受限与成年期发生心血管疾病包括肺动脉高压的风险密切相关。我们课题组前期发现EUGR大鼠成年期在没有其他诱发因素的情况下,平均肺动脉压力增高。这证实了肺血管对营养环境敏感的发育可塑性。目前,早产儿出生后宫外生长受限在新生儿临床中仍很常见。因此,有必要研究围产期不良应激影响心血管系统的潜在机制和可能的干预方法,以减少长期不良反应。肺高压是一种严重的进行性疾病,预后不良。肺动脉高压(PAH)的病理特征为肺动脉内皮细胞、肺动脉平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖、迁移、抗凋亡或细胞类型转换。肺血管的渐进性重塑导致肺血管阻力和右心室后负荷持续增加,最终导致不可逆性心力衰竭。越来越多的证据表明,肺动脉高压时Notch3通路被激活。Notch3是血管平滑肌细胞中的主要Notch受体,在决定晚期胚胎发育血管平滑肌细胞谱系方面具有重要意义。Notch受体(Notch 1-4)是一种单通道跨膜蛋白,从JAG(JAG1,JAG2)和Delta样(DLL1,DLL3和DLL4)基因家族编码的配体处接收信号。在与配体结合后,Notch受体经历由一系列蛋白酶(包括γ-分泌酶)介导的几个蛋白水解事件,导致这些受体的胞内结构域(ICD)释放。Notch ICD转移到细胞核,与转录因子形成活性转录复合物,激活效应基因转录。Notch信号的关键下游基因是Hes/Hey家族,在许多器官中被证明是Notch受体的下游。用γ-分泌酶抑制剂N-[N-(3,5-二氟苯乙酸基)-L-丙氨酸基]-S-苯基甘氨酸丁酯(DAPT)阻断Notch蛋白向ICD肽的裂解,是治疗PAH的一种有效的方法。多种病因,机制和分子可引起肺动脉高压,但发育性的肺部疾病导致肺动脉高压的机制尚不清楚。由于目前还没有对宫外生长受限的肺血管平滑肌细胞的功能方面的相关研究,结合前期的工作基础,我们从宫外生长受限诱导的肺动脉高压平滑肌细胞的角度探讨了肺动脉高压的机制,这可能为肺动脉高压提供一种新的解决方案。我们推测宫外生长受限与肺动脉高压的肺血管平滑肌细胞功能障碍有关,可能通过Notch通路引起疾病。第一部分 宫外生长受限诱导肺动脉高压的血管平滑肌细胞功能失调的研究目的:前期研究发现,宫外生长受限EUGR与成年期发生心血管疾病包括肺动脉高压的风险密切相关。肺动脉高压是一种严重的进行性疾病,预后不良。肺动脉高压的病理特征为肺动脉内皮细胞、肺动脉平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖、迁移、抗凋亡或细胞类型转换。由于目前还没有对宫外生长受限的肺血管平滑肌细胞的功能方面的相关研究,我们从宫外生长受限诱导的肺动脉高压平滑肌细胞的角度探讨肺动脉高压的机制。方法:1.建立EUGR大鼠模型:怀孕的Sprague-Dawley大鼠在整个妊娠期间都保持标准饮食。孕21天后分娩。在出生后24小时内,对幼崽进行称重,并随机分配成:10只仔鼠/窝(对照组)和20只仔鼠/窝(EUGR组),它们都具有1:1的雄雌比。出生后第21天断奶,雄性大鼠每笼4只,直到12周龄。2.肺动脉压力测定:3周龄大鼠采用开胸导管间接测量肺动脉压。成年大鼠经颈静脉导管测量平均肺动脉压。3.肺血管重构的评估:免疫组化检测肺动脉平滑肌特异性a-sma表达。4.原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的建立:分离大鼠肺动脉平滑肌组织,培养平滑肌细胞。5.细胞增殖检测:通过BrdU比色法细胞增殖试剂盒和细胞计数评估细胞增殖。6.细胞凋亡检测:通过Annexin V-FITC/PI双染细胞和TUNEL方法检测细胞凋亡。7.细胞迁移能力检测:通过细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测。8.荧光定量PCR:通过荧光定量PCR对肺动脉高压相关基因通路的全肺的表达水平进行初步的检测。结果:1.成年期12周EUGR大鼠的平均肺动脉压力和右心指数较Control组显著增高。2.EUGR大鼠的肺血管重构较Control组增加。3.EUGR大鼠的肺动脉平滑肌细胞细胞增殖和迁移能力增强。4.EUGR肺组织多种基因的mRNA表达水平与Control组相比有差异:Notch通路的 Jag1,Notch3,转录因子 Fox03,NRG/erbB 通路的 erbB3,TGF-B/BMP 通路的 Smad4。结论:1.大鼠宫外生长受限EUGR成年期存在显著的肺动脉压力增高,右心肥厚,肺血管重构增加。2.大鼠宫外生长受限EUGR的肺血管平滑肌细胞增殖、迁移能力增加,肺组织多种基因的mRNA表达水平改变。第二部分 肺动脉平滑肌细胞Notch3信号激活促进了宫外生长受限诱导的肺动脉高压目的:宫外生长受限与成年期发生心血管疾病包括肺动脉高压的风险密切相关。越来越多的证据表明,肺动脉高压时Notch3通路被激活。Notch3是血管平滑肌细胞中的主要Notch受体,在决定晚期胚胎发育血管平滑肌细胞谱系方面具有重要意义。我们从宫外生长受限诱导的肺动脉高压平滑肌细胞的角度探讨肺动脉高压的发生机制。方法:1.荧光定量PCR:检测大鼠肺动脉平滑肌细胞Notch通路的mRNA表达。2.蛋白质印迹(Western blot):检测肺动脉平滑肌细胞Notch通路的相关蛋白表达。3.石蜡切片免疫荧光染色:检测全肺Notch3的表达。4.原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的建立:分离大鼠肺动脉平滑肌组织,培养平滑肌细胞。5.用Notch通路γ-分泌酶抑制剂DAPT处理肺动脉平滑肌细胞:观察抑制剂对EUGR大鼠肺血管平滑肌的作用。6.慢病毒短发夹RNA(shma)沉默Notch3:通过敲除Notch3评估Notch3在EUGR大鼠肺血管平滑肌的作用。7.大鼠注射Notch通路γ-分泌酶抑制剂DAPT:EUGR和对照组大鼠随机接受剂量为10mg/kg的γ-分泌酶抑制剂DAPT,或同等体积的对照载体(DMSO)。8.细胞增殖检测:通过BrdU比色法细胞增殖试剂盒和细胞计数评估细胞增殖。9.细胞迁移能力检测:通过细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测。结果:1.在宫外生长受限诱导的肺动脉高压平滑肌组织中,Notch3和靶基因Hey1基因mRNA和蛋白表达上调,免疫荧光染色的表达增强。2.Notch信号通路抑制剂DAPT可减少EUGR肺动脉平滑肌细胞Notch3和靶基因Hey1的表达,减少EUGR平滑肌细胞的细胞增殖和迁移。3.EUGR大鼠肺动脉平滑肌细胞knockdown Notch3减少EUGR肺动脉平滑肌细胞Notch3和靶基因Hey1的表达,减少EUGR平滑肌细胞的细胞增殖和迁移。4.大鼠应用Notch通路γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch3可逆转体内肺动脉高压表型。结论:1.Notch3的高表达水平与EUGR诱导的PAH的发生发展相关。2.体外抑制剂处理和shRNA沉默Notch3可减少平滑肌细胞增殖和迁移。3.EUGR大鼠经Notch通路的抑制剂治疗可缓解肺动脉高压。