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桔小实蝇是重要的农业害虫,由于寄主范围广、适应能力强以及抗药性发展快速等因素,对其持续防控愈发困难。神经肽是昆虫体内一种重要的信号分子,通过激活G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors,GPCRs）调控昆虫的多种生理功能,阻断或扰乱神经肽信号传递系统的信号传导,能够达到控制害虫的目的。因此,神经肽信号传递系统被认为是一种理想的杀虫剂靶标。本学位论文基于桔小实蝇幼虫的骨化结构制订幼虫龄期的划分标准,基于基因组和转录组大数据,鉴定和注释双翅目88个物种的ETH前体基因;在此基础上克隆桔小实蝇ETH前体及其受体基因的cDNA序列,解析基因组结构信息;利用中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞表达系统及胞内钙离子流动测定技术,鉴定桔小实蝇的ETH信号传递系统。利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术,分析BdETH及其受体在桔小实蝇幼虫和雌虫体内的表达模式;运用免疫组化（Immunohistochemistry）和荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization）技术,定位桔小实蝇气管组织分泌表达BdETH的Inka细胞;采用活体钙离子成像技术,定位表达ETHR的组织;利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）、高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）以及行为学分析技术和方法,确定ETH信号传递系统在桔小实蝇幼虫和雌虫体内承担的具体生理功能;最后,利用三维建模、分子动力学模拟和分子盲对接分析,从分子结构角度可视化桔小实蝇BdETH1和BdETH2内源性配体分别与受体BdETHR-A和BdETHR-B的结合位点。研究旨在为将来进一步靶向昆虫ETH神经肽信号传递系统创制新型控制剂奠定理论基础。本学位论文主要研究结果如下:1桔小实蝇幼虫龄期的划分基于桔小实蝇幼虫的骨化结构,准确鉴定桔小实蝇各龄幼虫。研究结果表明,桔小实蝇幼虫分为3龄,头咽骨是幼虫龄期划分的最佳特征性结构,幼虫各项指标的测量值均随龄期的增长呈现出相同的增长规律。头咽骨长是划分桔小实蝇幼虫龄期的最佳测量指标,头咽骨宽、口钩长和口钩宽均可作为分龄的辅助指标;相邻龄期幼虫的体长变化范围存在重叠,不能准确划分幼虫龄期。2 ETH及其受体的注释、克隆及鉴定基于InsectBase数据库、I5K基因组数据库和1KITE数据库鉴定和注释了双翅目88种昆虫的ETH前体基因的序列,通过系统发育分析发现同属不同种的ETH前体氨基酸序列聚为一支,双翅目昆虫ETH前体一般具有的保守结构特征为信号肽+成熟肽1+成熟肽2,但采采蝇Glossina属5种昆虫、Mycetophila sp.、Megaselia abdita、Haematopota和Clusia lateralis共9个物种的ETH前体基因序列仅鉴定得到1个ETH1,成熟肽ETH2丢失。成熟肽的切割位点保守为赖氨基酸残基（K）和精氨基酸残基（R）组合,大多数ETH成熟肽C端具有酰胺化修饰,成熟肽均具有保守的C端继续XXPRLX amide（X表示任意氨基酸）。克隆获得了桔小实蝇BdETH前体基因及其受体基因BdETHR-A和BdETHR-B的cDNA序列,BdETH前体氨基酸序列均具有神经肽保守的结构特征。其中,BdETH前体含有2个成熟肽,并具有昆虫ETH保守的基序KxxKxxPRLx amide。此外,受体BdETHR-A和BdETHR-B具有7个跨膜结构域,为典型的G蛋白偶联受体,序列比对分析发现BdETHR-A和BdETHR-B与其它昆虫相应ETH受体的跨膜结构域序列具有高度的保守性,暗示ETH信号传递系统在种间具有相似的信号传导机制。另外,利用CHO表达系统对BdETHR-A和BdETHR-B进行瞬时表达,并采用细胞内钙离子流动测定的方法对BdETHR-A和BdETHR-B进行功能性测定,结果显示,BdETH1和BdETH2两个内源性配体均能够呈浓度依赖性的激活BdETHR-A和BdETHR-B,且EC50值达到nM级。其中,BdETH1、BdETH2对-BdETHR-A的EC50值为69±31 nM和769±182 nM;BdETH1、BdETH2对-BdETHR-B的EC50值为39±16 nM和30±11nM。其中,BdETH2-BdETHR-A的EC50值相比BdETH1-BdETHR-A的EC50值高10倍以上,暗示BdETH1配体在桔小实蝇ETH信号传递系统中起主导作用。3 ETH信号传递系统对桔小实蝇幼虫生长发育的调控qPCR分析结果表明,桔小实蝇BdETH、BdETHR-A和BdETHR-B在幼虫期均有所表达,但BdETH的表达模式具有组织特异性,且主要在幼虫气管组织表达;原位杂交和免疫组化的分析结果进一步确认BdETH主要在气管表达,并定位了分泌BdETH的Inka细胞位于气管与支气管的分支处,暗示BdETH可能与气管的发育相关。BdETHR-A和BdETHR-B在幼虫组织的表达较为广泛,BdETH与BdETHR-A的表达模式一致,暗示BdETH的配体通过受体BdETHR-A行使功能。利用饲喂法的RNAi技术分析ETH信号传递系统对桔小实蝇幼虫生理蜕皮的影响。结果表明,桔小实蝇一龄幼虫和二龄幼虫经dsRNA-ETH或dsRNA-ETHR-A处理后,由于蜕皮失败导致的死亡的数量显著升高,大多表现为新形成的气管出现缺口导致气管不能正常充气,旧气管无法褪去。另外,幼虫蜕皮过程出现典型的Buttoned-up表型。与之相反,饲喂dsRNA-ETHR-B后的桔小实蝇一龄幼虫和二龄幼虫蜕皮过程不受影响且均可正常进入下一龄期。由此可见,ETH通过ETHR-A调控桔小实蝇幼虫的两次生理蜕皮。4 ETH信号传递系统对桔小实蝇雌成虫生殖力的调控功能利用qPCR分析桔小实蝇BdETH、BdETHR-A和BdETHR-B在雌成虫羽化后0-25天发育过程中的表达模式。结果显示,BdETH、BdETHR-A和BdETHR-B在桔小实蝇雌成虫各发育时期均有所表达,且表达模式一致。通过解剖正常雌虫的卵巢,拍照分析发现羽化后的雌虫卵巢在前10天逐渐增大,到第10天时完全发育成熟,此结果与ETH信号传递系统在前10天的基因表达谱刚好相反,暗示ETH信号传递系统主要调控桔小实蝇雌虫在性成熟后的功能。利用原位杂交和免疫组化技术在mRNA和蛋白水平定位分析发现,分泌BdETH的Inka细胞位于雌成虫气管与支气管的分枝处,同时采用活体钙离子成像技术定位发现雌成虫的咽侧体组织表达BdETHR。采用RNAi和激素注射挽救方法研究ETH信号传递系统对桔小实蝇雌成虫生殖的调控作用。结果显示,分别注射桔小实蝇ETH（BdETH）及BdETHR-A、BdETHR-B共有部分（BdETHR）的dsRNA均能有效干扰靶标基因的表达水平,且靶标基因干扰后桔小实蝇雌虫的产卵量显著下降,保幼激素合成通路关键基因JHAMT和卵黄原蛋白合成的关键基因Vg2的表达水平也显著下降。随后,注射蜕皮激素类似物（20E）能有效挽救BdETH和BdETHR的表达量,注射保幼激素类似物（Met）也能挽救雌虫Vg2的表达量,并且注射20E或Met均能挽救雌虫的产卵量。根据上述研究结果,分析提出了ETH调控桔小实蝇雌虫繁殖力的理论模型:20E诱导Inka细胞分泌ETH,ETH激活咽侧体内的ETHR,促进JH的合成与分泌,同时JH促进卵黄原蛋白的合成最终影响雌虫的生殖力。5 ETH受体与配体相互作用的分子模拟采用同源建模、分子动力学模拟和分子盲对接分析,在构建的BdETH前体蛋白结构、BdETHR-A和BdETHR-B的三维结构模型基础上,以BdETH的两个成熟肽BdETH1和BdETH2作为配体,BdETHR-A和BdETHR-B受体作为靶标,分析结果结果显示BdETH1与BdETHR-A的结合位点分别是R16-V67、S3-T73、N1和E2-E70,BdETH2与BdETHR-A的结合位点分别是S1-C15、L6-T45,BdETH1与BdETHR-B的结合位点分别是L8-M41、F6和F7-R42,BdETH2与BdETHR-B的结合位点分别是K7和T11-T22、I15-N51。综上所述,本学位论文研究成果不仅丰富了昆虫ETH信号传递系统的信息,促进了ETH信号传递系统对昆虫蜕皮行为和生殖力调控的内分泌生理学机制的理解,还为靶向神经肽信号传递系统的新型激动剂和拮抗剂的创制提供了基础理论依据。