OsTRM13基因对tRNA中Am核苷修饰的功能研究

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tRNA中存在着大量的转录后修饰,这些修饰是由四种基础核苷Uridine、Cytidine、Guanosine和Adenosine衍化而来。它们的存在对tRNA的结构和功能有很大的影响,其中碱基或核糖的甲基化是最常见的转录后修饰,甲基化大多是由甲基转移酶(methyltransferase,或MTase)催化完成。甲基化修饰及相关甲基转移酶的功能已经在酵母和人类基因中得到了大量研究,但是在高等植物中相关的研究却少之又少,因此我们在本文中通过遗传学、植物生理学及蛋白体外生化等研究方法,试图研究tRNA甲基化修饰对水稻生长发育及逆境耐受的影响。本论文主要阐述了水稻tRNA-Am核苷修饰基因OsTRM13的相关功能研究。根据实验室前期研究结果:OsTRM13基因可以将酵母Am缺失突变体菌株中的Am修饰成功补回,且体外原核诱导的OsTRM13蛋白可以催化酵母tRNAGlyGCC第四位碱基C/A形成Cm/Am修饰,证明OsTRM13与酵母TRM13有类似的利用tRNA底物合成Am甲基化核苷的功能;OsTRM13基因的超表达材料和RNAi材料的研究表明OsTRM13基因的表达水平影响tRNA上Am核苷修饰的合成及水稻的正常生长;超表达材料中Am核苷修饰含量明显升高,且表现出对高盐胁迫耐受性提高;RNAi材料中Am核苷修饰含量明显降低,且表现出对高盐胁迫耐受降低(Wang et al 2017)。本课题从前期研究中获得的水稻OsTRM13 CRISPR突变体材料入手,继续开展了OsTRM13基因的功能研究,包括CRISPR突变体表型分析及Am核苷修饰检测、基因的组织特异表达、以水稻内源tRNA为底物的体外甲基化实验、以及OsTRM13CRISPR材料与野生型的转录组比较分析等。主要研究结果如下:1.OsTRM13 CRISPR突变体材料生长矮小,结实率低;2.OsTRM13 CRISPR突变体材料Am核苷修饰含量显著低于野生型;3.GUS染色结果显示,OsTRM13在孕穗期穗子及茎节中均有表达;4.OsTRM13可以在体外诱导但不能甲基化水稻底物tRNAMetCAT和tRNAAsp GTC;5.转录组比较分析显示OsTRM13 CRISPR突变体与野生型间的差异表达基因主要与氧化还原、转录调控、氨基酸以及核酸代谢等途径相关,部分解释了OsTRM13对高盐胁迫表型的作用机理。
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