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小反刍兽疫(Peste Des Petits Rumminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste Des Petits Rumminants Virus,PPRV)引起的一种急性、主要感染小反刍动物的传染病。PPR因其发病率、死亡率高,给养羊业带来严重危害。为研究PPRV非结构蛋白C介导的天然免疫机制,本研究运用实时荧光定量PCR技术(qPCR),检测了C基因在转录水平对维甲酸诱导基因I样受体(retinoic-acid-inducible gene I like receptor,RLRs)通路中干扰素(interferons,IFNs)及其下游因子的作用;双荧光素酶报告系统检测、筛选了C蛋白在RLRs通路中的作用靶点;进一步实验分析了C蛋白对内、外源性干扰素抗病毒效应的影响及对转录信号转导和活化因子1(signal transducers and activators of transcription I,STAT1)的磷酸化影响。获得以下研究结果:1.共转pRK-Flag-RIG-IN和pCMV-HA-C至HEK293T细胞,qPCR检测表明PPRV C蛋白抑制RLRs信号通路介导的INF-β的生成及其下游因子干扰素诱导基因15(interferon stimulated gene,ISG15)、ISG56、CXC趋化因子配体10基因(C-X-C motif chemokine,CXCL10)在基因转录水平的表达。2.HEK293T细胞中先分别转染内参质粒pRL-TK和报告基因质粒pGL3-IFN-β、pGL3-ISRE、pGL3-NF-κB,实验组共转pRK-Flag-RIG-IN和pCMV-HA-C,阴性对照组转染pCMV-HA,阳性对照组转染pRK-Flag-RIG-IN。双荧光素酶报告基因系统检测表明PPRV C蛋白在细胞内的过表达可以极显著抑制RLRs通路中由RIG-IN介导的IFN-β(p<0.001)、NF-κB(p<0.01)和ISRE(p<0.001)报告基因活性。双荧光素酶报告基因系统进一步检测表明PPRV C蛋白在细胞内的过表达呈剂量依赖性的显著抑制RLRs通路中由RIG-IN介导的线粒体抗病毒信号分子(mitochondrial antiviral signaling,MAVS)激活的IFN-β启动子活性(p<0.05),对其他信号分子IκB激酶复合体?(IκB kinase,IKK?)、TANK结合激酶1(TRAF family member-associated NF-κB activator(TANK)-binding kinase 1,TBK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子3(tumor necrosis factor receptorassociated factor 3,TRAF3)、干扰素调节因子3(interforn regulatory factor,IRF3)、IRF7的活性无明显抑制作用(p≥0.05),表明C蛋白在RLRs通路中的作用靶点是MAVS。3.共转染pCMV-HA-C和pRK-Flag-RIG-IN至HEK293T细胞24h后收集上清,分别加入到新培养的HEK293T细胞中继续培养细胞24 h后分别接种PPRV、脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)和水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)病毒,qPCR检测表明PPRV C蛋白可极显著增高细胞中三种病毒mRNA的表达(p<0.001)。共转染pCMV-HA-C和pRK-Flag-RIG-IN至HEK293T细胞24h后加入商品化IFN-β(1000 U/mL)处理细胞24 h后分别感染三种病毒,qPCR检测表明C蛋白也极显著增高细胞中三种病毒mRNA的表达(p<0.001),表明PPRV C蛋白质可显著抑制内源和外源IFN产生的抗病毒作用。4.实验组和对照组HEK293T细胞中分别转染pCMV-HA和pCMV-HA-C后,加入IFN-β(1000U/mL)处理细胞激活细胞干扰素应答通路,Westernblot检测表明实验组和对照组STAT1的表达量基本没有差异,而实验组中P-STAT1表达的量减少。说明PPRV C蛋白可抑制STAT1的磷酸化,但其阻断JAK-STAT通路信号传递产生抑制干扰素的抗病毒作用机制仍需进一步研究。本文研究了PPRV非结构蛋白C在宿主细胞内介导的天然免疫机制,明确了C蛋白可抑制RLRs通路中RIG-I介导的IFNs产生和信号转导基本分子机制,证实了C蛋白抑制IFNs的广谱抗病毒作用,初步得出C蛋白抑制JAK-STAT通路中STAT1磷酸化是其抑制IFN产生的抗病毒作用的原因。这些结果对进一步阐明PPRV非结构蛋白介导的天然免疫机制奠定了基础。