超声波用于强化海藻糖载入血小板的研究

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冷冻干燥是保存血小板最理想的方法之一,具有储存期限长、运输方便、输注安全等优点。但是冷冻和干燥过程剧烈的环境变化会对细胞膜和胞内物质造成大规模损伤,最终导致细胞死亡或失去生物功能。通过大量研究发现,细胞内海藻糖能有效地保护冻干过程中的血小板,但是海藻糖是一种非渗透性保护剂,不能自由穿过细胞膜进入血小板细胞内,且血小板自身不能产生海藻糖,所以在冻干前必须在血小板细胞内载入一定量的海藻糖。 目前有热孵化、利用可开关小孔、基因修改、电穿孔、显微注射等几种将海藻糖引入哺乳动物细胞的实验方法,但对于不同种类细胞不具有通用性,大规模的临床应用还有一定的难度。本文将超声波法用于海藻糖载入血小板,与上述方法相比,超声波法是一种物理的而非化学的、非滤过性病毒的、非侵入性的、非扩散性的方法,更适用于各种药物和各种细胞。 本文自行设计搭建实验台并研究了超声波法用于强化海藻糖载入血小板的可行性。用到的超声波有两种:高频800kHz和低频25kHz。通过建立超声波的传播模型,理论估计了试样中超声波的强度。实验中血小板的孵化条件为:温度37℃、细胞外海藻糖溶液浓度50mM、孵化时间4h。 研究表明,对于高频超声波,施加超声时间的长短对海藻糖载入量影响不大。在高频超声估算强度0.4W/cm~2、1.2W/cm~2时,加超声组海藻糖载入量与对照组(即不加超声波组)无显著性差异。在高频超声估算强度0.8W/cm~2,施加30min超声波可使海藻糖载入量增加42%,施加1h可使海藻糖载入量增加54%,均与对照组有显著性差异。在细胞计数和体积膨胀率上与对照组没有显著性差异。 低频超声波能大大提高海藻糖的载入量。在估算强度0.4W/cm~2时施加超声1h可使海藻糖的载入量提高188%;在估算强度0.8W/cm~2时施加超声30min可使海藻糖的载入量提高172%,血小板内海藻糖浓度达到30.65mM。在细胞计数和体积膨胀率上与对照组没有显著性差异,通过显微镜观察,经过超声波处理的血小板在形态上与对照组无明显差异。
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