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研究背景心肌炎是儿童及青少年的常见疾病。心肌炎早期症状不典型,易造成漏诊和误诊,可迅速发生心力衰竭、恶性心律失常,甚至猝死。目前对心肌炎的诊断主要依靠临床特点、心肌损伤标志物、心电图、胸片、超声心动图及心脏磁共振等综合判断,缺乏无创性、特异性、客观性的生物学标志物;在治疗方面主要是经验性和对症治疗,缺乏靶向性和个体化的治疗方案,据报道约20%的心肌炎患者发展为慢性心肌炎,导致扩张型心肌病或心力衰竭。心肌炎的发病机制尚未完全阐明,目前认为主要包括急性感染期病原体复制介导的直接损伤和亚急性期继发性免疫应答引起的间接损伤。病原引起的炎症反应是心肌炎持续和进展的关键,因此深入研究病原入侵时调控心肌炎症反应的分子和通路对阐明心肌炎的发病机制至关重要。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类新型的非编码RNA,生物学功能广泛,可以作为miRNA海绵、转录或翻译调控因子和蛋白翻译模板等发挥作用,已被证实与代谢性疾病、肿瘤、退行性病变和免疫炎症等多种人类疾病有关。环状RNA的闭合环状结构具有高度稳定性,可以在外周血中稳定存在,故有潜力作为疾病的生物学标志物。然而,目前尚缺乏环状RNA在心肌炎中系统、完整的表达谱分析、功能分析和分子机制研究。探究环状RNA在心肌炎中的作用和分子机制,不断寻找新的生物标志物和治疗靶点,对心肌炎的早期诊断、早期治疗和预后改善意义重大。研究目的本研究以环状RNA在心肌炎中的作用和机制为主要方向,分为三个部分进行,目的如下:1.通过基因芯片测序和生物信息学分析进行环状RNA在心肌炎中的表达谱分析和功能分析,筛选并确定目的分子。2.对第一部分筛选并确定的环状RNA分子circACSL1（ID:hsacirc0071542）在心肌炎中的表达水平和临床意义进行评估,初步探究circACSL1能否作为临床上心肌炎诊断和预后评估的生物标志物。3.深入探究circACSL1在心肌炎中的生物学功能,并阐释circACSL1发挥调控作用的分子机制,为心肌炎的早期诊断和靶向治疗提供新的方向。研究方法1.环状RNA在心肌炎中的表达谱分析和功能分析①收集3例心肌炎和3例对照组儿童的外周血样本,通过Sino human ceRNA array V3.0芯片筛选差异表达的circRNA和mRNA。②通过生物信息学方法对差异表达的circRNA和mRNA进行功能分析,包括GO和KEGG pathway富集分析、构建circRNA-miRNA-mRNA的相互作用网络等。③挑选7个可能与免疫、炎症相关的环状RNA分子,扩大样本量,采用qRT-PCR技术在8例心肌炎患儿和8例健康对照儿童中进行验证。2.环状RNA circACSL1在心肌炎中的表达水平和临床意义①纳入22例急性心肌炎患儿、20例健康对照组儿童和25例扩张型心肌病患儿,采集外周血样本。②收集以上研究对象的基线资料和相关临床信息。③qRT-PCR检测各样本中circACSL1的表达水平,并进行统计学分析。3.环状RNA circACSL1通过miR-8055/MAPK14调控心肌细胞炎症和心肌损伤的作用机制①培养人心肌细胞系（AC16）。②进行核糖核酸外切酶（Ribonuclease R,RNase R）耐受性实验验证circACSL1的环状结构;通过RNA荧光原位杂交技术（FISH）确定circACSL1在细胞中的定位。③脂多糖（LPS）诱导心肌细胞炎症,qRT-PCR检测心肌炎细胞模型中circACSL1和miR-8055的表达,qRT-PCR和Western Blot检测MAPK14的表达水平。④心肌细胞过表达或敲降circACSL1,在或不在LPS刺激下,评估心肌细胞的炎症程度:qRT-PCR和ELISA检测炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和心肌损伤标志物（cTnT、CKMB、BNP）的表达,CCK8检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡率。⑤过表达或敲降circACSL1后,检测miR-8055和MAPK14的表达水平;过表达或敲降miR-8055后,检测MAPK14的mRNA和蛋白水平。⑥过表达结合位点突变的circACSL1慢病毒载体,检测miR-8055和MAPK14的表达水平。⑦FISH检测circACSL1和miR-8055是否在细胞内共定位;双荧光素酶报告基因实验和 RNA pull down 实验验证 circACSL1 和 miR-8055、miR-8055 和 MAPK14 的结合关系及结合位点。⑧心肌细胞过表达或敲降miR-8055,在或不在LPS刺激下,评估心肌细胞的炎症程度:检测炎症因子和心肌损伤标志物的表达,检测细胞增殖和凋亡。⑨设计回复（挽救）实验:（1）心肌细胞同时过表达circACSL1和miR-8055;（2）心肌细胞同时敲降circACSL1和miR-8055;（3）心肌细胞敲降circACSL1的同时过表达MAPK14;（4）心肌细胞过表达miR-8055的同时过表达MAPK14。评估心肌细胞的炎症程度。研究结果1.环状RNA在心肌炎中的表达谱分析和功能分析①CircRNA在心肌炎患儿和正常对照儿童中的表达存在明显差异。统计分析共3173个circRNAs存在差异表达（p＜0.05,差异倍数＞2倍）,其中2281个上调,892个下调。②GO富集分析提示差异表达的circRNAs主要参与T细胞的分化、信号转导的负调控和蛋白修复等生物过程。③KEGG通路分析发现,差异表达的circRNAs主要富集在T细胞受体通路、Th1和Th2细胞分化和TNF信号通路。④qRT-PCR结果显示hsacirc0071542在心肌炎组较对照组上调2.5倍,有统计学差异（p＜0.05）且与芯片测序的趋势一致。⑤根据circRNA-miRNA-mRNA相互作用网络,预测hsacirc0071542可以竞争性吸附miR-8055,进而调控靶基因MAPK14的表达。hsacirc0071542来源于母基因ACSL1,因此将其命名为circACSL1。2.环状RNA circACSL1在心肌炎中的表达水平和临床意义①与对照组相比,心肌炎组circACSL1的表达水平明显增高。②circACSL1在恢复期的表达水平明显低于急性期。③在心肌炎病程中,circACSL1的动态变化与心肌损伤标志物Hs-cTnT和心功能不全标志物NT-proBNP的动态变化趋势基本一致。④circACSL1在心肌炎组的表达水平明显高于扩张型心肌病组,且circACSL1在扩张型心肌病组中的表达水平与对照组无明显差异。3.环状RNA circACSL1通过miR-8055/MAPK14调控心肌细胞炎症和心肌损伤的作用机制①circACSL1的分子特点:circACSL1主要存在于细胞质中,具有环状结构,不受Rnase R消化;circACSL1不存在于基因组DNA,是在转录过程中产生的。②circACSL1具有促进心肌细胞炎症反应、加重心肌损伤的作用:心肌细胞过表达circACSL1后,炎症因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）和心肌损伤标志物（cTnT、CKMB和BNP）的表达水平较对照组明显增高,细胞增殖活性显著下降,凋亡率明显增加;心肌细胞敲降circACSL1后,炎症因子和心肌损伤标志物的表达明显下降,细胞增殖活性增强,凋亡率下降。③circACSL1通过海绵样吸附miR-8055调控靶基因MAPK14的表达:在心肌炎临床样本和心肌炎细胞模型中,miR-8055表达下调,MAPK14表达上调;过表达circACSL1 后,miR-8055 表达下降,MAPK14 表达增加;敲降 circACSL1 后,miR-8055表达增加,MAPK14表达下降;过表达circACSL1的突变载体后,miR-8055和MAPK14的表达无明显变化;过表达miR-8055后,MAPK14表达下降;敲降miR-8055 后,MAPK14 表达增加;双荧光素酶报告基因实验和 RNApull down 实验证实circACSL1和MAPK14的3’UTR区域分别与miR-8055的种子序列相结合。④miR-8055具有抑制心肌细胞炎症反应、减轻心肌损伤的作用:过表达miR-8055后,心肌细胞中炎症因子和心肌损伤标志物的表达下降,细胞增殖活性增强,凋亡率下降;敲降miR-8055后,炎症因子和心肌损伤标志物的表达增加,细胞增殖活性下降,凋亡率增加。⑤circACSL1通过miR-8055/MAPK14发挥促心肌炎的作用:过表达miR-8055可以减轻circACSL1对心肌细胞炎症和心肌损伤的加重作用;敲降miR-8055可以挽救敲降circACSL1对心肌细胞炎症和心肌损伤的抑制作用;过表达MAPK14可以逆转敲降circACSL1对心肌细胞炎症和心肌损伤的抑制作用;过表达MAPK14可以逆转miR-8055对心肌细胞炎症和心肌损伤的抑制作用。结论1.环状RNA在儿童心肌炎和健康对照组中的表达存在明显差异,可能通过调控炎症、免疫相关的病理生理过程参与心肌炎的发病和疾病进展。2.CircACSL1在心肌炎急性期明显高表达,并且与心肌炎的疾病进程相关,有作为心肌炎生物标志物的潜力。3.CircACSL1具有加重心肌细胞炎症和心肌损伤的作用,其可能是通过miR-8055/MAPK14通路发挥作用,具体表现为circACSL1通过竞争性吸附miR-8055上调MAPK14的表达,进而促进炎症反应。