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ATP结合盒转运体G1(ATP-binding cassette transporter G1, ABCG1)在维持细胞内胆固醇和脂质平衡起着至关重要的作用。ABCG1介导的胞内胆固醇外流在胆固醇逆转运中发挥重要作用,但ABCG1基因敲除动物模型的研究结果并不一致。巨噬细胞ABCG1的表达在动脉粥样硬化发生中的作用仍存在很大争议。我们实验室对ABCG1基因单核苷酸多态性与冠心病发病的相关性研究显示,ABCG1启动子区rs7137919G>A多态性与人群冠心病发生呈负相关,首次发现人ABCG1基因可能具有致动脉粥样硬化作用。据此,本研究在此基础上进一步探索携带ABCG1rs57137919G>A受试者外周血单核巨噬细胞与动脉粥样硬化关联的一些功能学证据。同时,为了进一步更全面地研究巨噬细胞ABCG1与动脉粥样硬化相关的功能及机制研究,本研究在人源单核巨噬细胞研究的基础上,同时采用人单核／巨噬细胞系THP-1及小鼠单核巨噬细胞系J774.1细胞为研究对象,通过慢病毒感染的方法构建敲低或过表达ABCG1的稳定细胞株,观察ABCG1表达对巨噬细胞胆固醇沉积、外流、迁移、凋亡等整体功能的影响,同时进一步揭示其中相关的分子机制,探索巨噬细胞ABCG1在动脉粥样硬化发病中的作用和机制。研究目的1.探索ABCG1启动子区rs57137919G>A多态性对人单核巨噬细胞ABCG1表达及巨噬细胞功能的影响,提供人单核巨噬细胞ABCG1rs57137919G>A与动脉粥样硬化关联的一些功能学证据。2.利用人单核／巨噬细胞系THP-1及小鼠单核巨噬细胞系J774.1细胞探索ABCG1敲低或过表达对巨噬细胞各项功能的影响；初步探讨相关机制。研究方法1.提取不同基因型外周血单核细胞并诱导分化为巨噬细胞,检测rs57137919不同基因型受试者的单核巨噬细胞ABCG1的蛋白及mRNA的表达；观察携带不同基因型受试者巨噬细胞ABCG1介导的NBD-胆固醇外流率：通过流式细胞学分析不同基因型巨噬细胞与ox-LDL孵育后发生的凋亡水平,并检测凋亡相关基因的表达水平;2.针对目的基因人ABCG1或小鼠ABCG1基因的靶基因序列,构建该基因的多个shRNA慢病毒干扰载体；利用293T细胞进行慢病毒包装；病毒包装成功后多条慢病毒shRNA分别感染靶细胞THP-1细胞或J774.1细胞,采用Western Blot和Real Time PCR验证干扰效果,筛选出沉默效果最好的一条慢病毒shRNA感染靶细胞,最后得到稳定敲低ABCG1的细胞株；3.将目的基因构建到过表达慢病毒载体上,最后利用293T细胞进行慢病毒的包装,将病毒原液浓缩。病毒感染靶细胞,构建ABCG1过表达慢病毒稳定株；4.利用构建好的敲低或过表达的巨噬细胞系,利用荧光探针标记的ox-LDL测定吞噬功能,高效液相色谱法测定胆固醇沉积,NBD-胆固醇方法测定胆固醇外流功能,Transwell小室迁移实验测定巨噬细胞趋化迁移能力,流式细胞仪检测巨噬细胞凋亡,ELISA试剂盒检测巨噬细胞释放的炎症因子,通过以上实验观察ABCG1的表达对巨噬细胞功能的影响及与动脉粥样硬化的可能关系；5.通过实时荧光定量PCR法和Western blot方法检测ABCG1相关的蛋白和]mRNA的表达,探索相关的分子机制。研究结果—ABCG1rs57137919G>A基因多态性对人单核巨噬细胞功能的影响1.将志愿者按照ABCG1-367G>A基因型不同分为三组：G/G型(n=28)、G/A型(n=25)和A/A型(n=9)。健康受试者年龄、性别、BMI、 TC、 TG、 HDL-C、 LDL-C三组间均没有统计学差异；2.与G/G型(n=25)相比,G/A型(0.87±0.04,n=22)和A/A型(0.41±0.10,n=9)单核巨噬细胞ABCGl mRNA表达均明显下调(p<0.01)；G/A型单核巨噬细胞ABCG1蛋白表达水平明显低于G/G型(p<0.05),且A/A型蛋白表达减少更明显(p<0.01)；3. ABCG1介导的巨噬细胞胆固醇外流率测定结果显示,比较G/G组(29.6±2.1%,n=15),G/A组(24.9±2.9%,n=11)与A/A组(22.9±3.8%,n=9) PBMCs来源的巨噬细胞在ABCG1介导的胆固醇外流率均明显减少(p<0.01)；4.与G/G型巨噬细胞(15.97±2.55%,n=9)比较,G/A型(26.5±3.57%,n=9)和A/A型(30.44±2.18%,n=9)巨噬细胞的凋亡均显著增加(p<0.01)。 PBMCs巨噬细胞与50μg/ml ox-LDL预孵育48h后检测各组细胞中促凋亡基因Bok和Bid基因mRNA表达水平。结果显示与G/G组(n=9)相比,A/A组巨噬细胞表达Bid和Bok基因显著增高(p<0.01)。二ABCG1敲低或过表达慢病毒载体的构建与包装以及稳定细胞株构建1.通过实时荧光定量PCR检测THP-1细胞ABCG1的mRNA水平验证敲低的效果,表明shRNA1、 shRNA2、 shRNA3和;hRNA4的沉默效率分别为75.3%、58.2%、100.3%和86.4%。表明4条shRNA中的3条具有干扰效果。经Western Blot验证,shRNA1、 shRNA2、 shRNA3、 shRNA4对ABCG1都有较好的沉默效果,使蛋白表达量减低。利用敲低效果最好的shRNA3构建稳定低表达ABCG1的THP-1细胞株；2.通过实时荧光定量PCR检测J774.1细胞ABCG1的mRNA水平验证敲低的效果,表明shRNA1、 shRNA2、 shRNA3、 shRNA4、 shRNA5和shRNA6均对ABCG1有沉默作用,效率分别为-26%、-39%、0%、-22%、56.6%和0%。经Western Blot验证,shRNA3、 shRNA4、 shRNA5和shRNA6对ABCG1蛋白都有较好的沉默效果。使用敲低效果最好的shRNA5构建稳定低表达ABCG1的J774.1细胞株；3.构建的过表达慢病毒载体感染THP-1细胞后,经Western Blot验证,THP-1细胞中ABCG1过表达效果较好,ABCG1蛋白表达量增加。三ABCG1敲低或过表达对巨噬细胞功能的影响1.不同浓度Dil-ox-LDL孵育4h后,荧光显微镜显示shRNA组J774.1巨噬细胞表面和胞浆内红色荧光较对照组红色荧光明显增强。同时流式细胞仪分析荧光强度,25、50、 lOOμg/m1Dil-ox-LDL孵育的shRNA巨噬细胞平均荧光强度均较NC对照组明显增强(p<0.01),表明ABCG1敲低可以促进巨噬细胞摄取修饰的LDL；2.不同浓度ox-LDL孵育24h后高效液相色谱检测shRNA组和NC组J774.1巨噬细胞胆固醇的含量,可以看到shRNA组巨噬细胞胆固醇含量较NC组显著增加(p<0.05),且随着培养液中ox-LDL浓度的增高差异更加明显,说明ABCG1敲低可促使巨噬细胞胆固醇沉积。3.负载50p,g/ml ox-LDL的THP-1细胞,与NC组相比,shRNA组ABCG1介导的胆固醇外流率明显降低(p<0.05)；在lOOμg/ml ox-LDL负载下,shRNA组ABCG1介导的外流较NC组减少更加明显(p<0.01)。以往研究显示ABCG1介导的外流减少具有促巨噬细胞凋亡的作用。负载不同浓度ox-LDL, apoA-I及标准血清诱导的胆固醇外流在NC组和shRNA组均未见明显差异(p>0.05)；25μg/ml或100μg/ml ox-LDL负载过表达ABCG1的THP-1巨噬细胞,HDL、apoA-I及标准血清诱导的胆固醇外流在过表达OE组和对照组均未见明显差异(p>0.05)。4.负载l00μg/ml ox-LDL的J774.1巨噬细胞,与NC组相比,shRNA组ABCG1介导的胆固醇外流率显著降低(p<0.01)；负载50μg/ml和25μg/ml ox-LDL shRNA组较NC组外流减少,但不具有统计学差异。负载不同浓度ox-LDL, apoA-I及标准血清诱导的胆固醇外流在NC组和shRNA组均未见明显差异；5.与对照组相比,ABCG1敲低的THP-1细胞穿过微孔膜的细胞数量显著减少(p<0.01),提示ABCG1的表达减少可以抑制单核细胞的趋化迁移能力；同时ox-LDL干预进一步抑制了NC组和shRNA组单核细胞的迁移,而且这种抑制作用在shRNA组THP-1单核细胞更加显著(p<0.001)。6.与NC组相比,ABCG1-shRNA组迁移穿过微孔膜的J774.1巨噬细胞数量显著减少(p<0.01),且在ox-LDL干预后,shRNA组J774.1细胞迁移的数量减少更加显著(p<0.001),提示ABCG1的表达减少可以抑制J774.1巨噬细胞的趋化迁移能力,而在ox-LDL干预下抑制作用更加显著。7.与NC组比较,ABCG1-shRNA组THP-1巨噬细胞凋亡明显增加(p<0.001);负载ox-LDL50μg/ml24h后,与NC组比较,ABCG1-shRNA组巨噬细胞凋亡显著增加(p<0.001)。以往研究显示巨噬细胞凋亡增加具有抑制早期动脉粥样硬化形成的作用。而过表达ABCG1的THP-1巨噬细胞凋亡与NC组比较没有显著差异(p>0.05)。8.在不同浓度ox-LDL干预下,与NC组比较,shRNA组THP-1巨噬细胞释放的TNF-a显著增加。ox-LDL50、100μg/ml干预下,shRNA组THP-1巨噬细胞释放IL-1β显著增加。推测shRNA组巨噬细胞炎症因子表达增加可能与其凋亡加快有关。而过表达OE组与对照组释放TNF-a和IL-1β没有显著差异。9.通过实时荧光定量PCR及western blot方法检测了与ABCG1相关分子的mRNA及蛋白的表达水平。结果表明shRNA组比较NC组CD36、SR-A、PPAR-Y及ABCA1的mRNA及蛋白表达量显著增加,而SR-B1mRNA及蛋白表达没有明显变化。而过表达OE组与对照组各个分子表达没有表现出明显差异。研究结论1.本课题对人单核巨噬细胞的研究揭示了ABCG1rs57137919G>A位点变异与ABCG1表达减少和巨噬细胞凋亡增加是内在相关的,后者可能具有抑制早期动脉粥样硬化的作用；2.与人单核巨噬细胞研究结果一致,ABCG1敲低导致巨噬细胞吞噬能力增强、胆固醇沉积增加以及ABCG1介导的胆固醇外流减少(尤其是氧化固醇外流减少),可能是导致巨噬细胞凋亡增加的原因；3. ABCG1敲低的J774.1巨噬细胞趋化能力降低,扩展增加,迁移能力受损,从损伤区移除的能力减弱可能与巨噬细胞胆固醇外流减少、氧化固醇堆积有关。ABCG1敲低的巨噬细胞释放的炎症介质TNF-α和IL-1β水平增高,可能是ABCG1敲低后特异氧化固醇堆积、细胞凋亡增加伴随的反应。