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目的:为了探讨具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)内毒素(LPS)通过上调 TLR4 的表达,对 PAK1、PAK1(Thr423)、beta-catenin、beta-Catenin(S675)、Cyclin-D1、C-myc 等蛋白水平表达的影响,揭示Fn在结直肠癌变过程中的致病机制。方法:用免疫组化方法检测结直肠癌(CRC)、增生性息肉(HP)、腺瘤(AD)中PAK1和TLR4的表达情况,利用荧光原位杂交方法检测近端CRC、远端CRC、SSA、近端HP、远端HP、近端TA、远端TA、CRC相应转移淋巴结和无转移淋巴结中Fn的丰度及组织定位情况;从临床收集的CRC标本中分离培养Fn,然后从这些Fn中提取LPS,将其作用于结肠癌细胞株SW480,同时用商品化LPS以相同条件作用结肠癌SW480细胞,利用Western-blot方法检测对TLR4、PAK1、PAK1(Thr423)、beta-catenin、beta-catenin(S675)、Cyclin-D1、C-myc等蛋白表达的影响。利用TLR4特异性拮抗剂TAK-242和PAK1特异性拮抗剂IPA-3作用结肠癌SW480细胞,Western-blot方法观察对下游相关蛋白的表达变化。采用细胞免疫荧光,观察FnLPS、TAK-242、IPA-3作用细胞后,beta-catenin(S675)在细胞内的表达及定位的变化。结果:(1)免疫组化结果显示:PAK1和TLR4在这三种组织中阳性率高,呈高表达,3组之间阳性率差别无统计学意义(P>0.05); (2)荧光原位杂交结果显示:近端CRCs中Fn阳性率为89.6%,近端HPs中Fn阳性率为65.7%,SSAs中Fn阳性率为78.8%,近端TAs中Fn阳性率为28.9%,远端CRCs中Fn阳性率为42.2%,远端HPs中Fn阳性率为47.5%,Fn在远端TAs中的阳性率为24.4%,在转移淋巴结中的阳性率为100%,而无转移淋巴结中Fn阳性率为40%; Fn普遍存在于近端SP中,TA中少见(P<0.05),近端CRCs和转移淋巴结中Fn较远端CRCs和无转移淋巴结中Fn阳性率高(P<0.05);(3)Western-blot结果显示,从临床Fn提取的LPS和商品化的LPS对SW480细胞内 Cyclin-D1、C-myc、PAK1、PAK1(Thr423)、beta-catenin、beta-catenin(S675)、TLR4的蛋白表达有相似影响作用。随着两种LPS对细胞的作用时间延长(0,2,6,12,24h),PAK1、beta-catenin的表达无明显变化,TLR4、PAK1(Thr423)、beta-catenin(S675)、Cyclin-D1、C-myc 的表达呈递增趋势(P<0.05),此趋势在FnLPS作用细胞中更为明显;以TAK-242作用结肠癌SW480细胞,随着作用时间延长(0, 2, 6, 12, 24h),PAK1、beta-catenin 的表达无明显变化,PAK1(Thr423)、beta-catenin(S675)、Cyclin-D1的表达呈递减趋势(P<0.05),TLR4、C-myc的表达呈先增后减趋势;以IPA-3作用于结肠癌SW480细胞,随着作用时间延长(0,2,6,12,24h),PAK1、beta-catenin 的表达无明显变化,PAK1 (Thr423)、beta-catenin(S675)、Cyclin-D1的表达呈递减趋势(P<0.05),TLR4的表达呈递增趋势,C-myc的表达呈先增后减趋势;同时将Fn LPS、TAK-242、IPA-3作用于SW480 细胞,PAK1、beta-catenin 的表达无明显变化,TLR4、PAK1(Thr423)、beta-catenin (S675)、Cyclin-D1、C-myc 的表达呈先增后减趋势(P<0.05)。Fn 的 LPS 通过提高 TLR4 的表达来促进 PAK1(S423)、beta-catenin(S675)的磷酸化,激活beta-catenin信号通路,进而促进CRC的发生发展。(4)细胞免疫荧光结果显示:Fn-LPS、TAK-242、IPA-3组合作用于SW480细胞,TAK-242、IPA-3预处理细胞,其beta-catenin(S675)的表达较对照组未预处理细胞中beta-catenin(S675)的表达量低,并且beta-catenin(S675)的明显核聚集现象可在对照组细胞中观察到。结论:具核梭杆菌LPS通过激活TLR4/PAK1(Thr423)/beta-catenin(S675)信号通路,促进结直肠肿瘤的发生发展。