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近年来研究表明,食管酸刺激可诱导气道产生神经源性炎症,目前认为食管与气道间存在迷走神经介导的“食管-支气管反射”通路。除了盐酸,其他不同物理化学性质的溶液刺激食管是否会诱导气道炎症改变,目前未见报道。瞬时受体电位通道蛋白(transient receptor potential, TRP)是机体介导伤害性刺激信号的起始环节,其中瞬时感受器电位香草酸受体-1( transient receptor potential vanillic-1, TRPV1)和瞬时感受器电位锚蛋白-1(transient receptor potential ankyrin-1)分别是感受热、冷刺激的温度感受器,且对多种化学性刺激敏感,在消化系统均有分布。本研究旨在观察不同理化性质溶液灌注食管对气道的影响及探讨TRPV1和TRPA1在发生机制中的作用。第一部分不同理化性质溶液豚鼠食管灌注对气道炎症的影响及机制探讨分题一灌注对气道血浆渗出和炎症细胞的影响目的:建立单次持续灌注食管的模型,观察不同理化性质溶液刺激豚鼠食管是否诱导气道血浆渗出及探讨发生机制。方法:1.根据灌注液性质,将Hartlay白化豚鼠分为7组:①空白组;②对照组(37℃生理盐水);③冷刺激组(4℃NS);④热刺激组(45℃NS);⑤盐酸(0.1M)刺激组;⑥高渗刺激组(50%葡萄糖溶液);⑦乙醇刺激组(40%乙醇)。2.根据TRPA1和TRPV1受体拮抗剂和神经内肽酶抑制剂Phosphoramidon(磷阿米酮,PHOS)干预,分为8组:①冷刺激+TRPA1拮抗剂(HC-030031)组;②冷刺激+Phosphoramidon组;③热刺激+TRPV1拮抗剂(Capsazepine)组;④热刺激+ Phosphoramidon组;⑤盐酸刺激+ Capsazepine组;⑥盐酸刺激+Phosphoramidon组;⑦乙醇刺激+Capsazepine组;⑧乙醇刺激+Phosphoramidon组。3.根据神经通路:冷刺激+阿托品+心得安组。4.豚鼠食管持续灌注不同理化性质溶液(1ml/min, 20min),分别观察气管、主支气管和细支气管的血浆渗出、支气管肺泡灌洗液炎症细胞总数分类,并观察分别应用神经内肽酶抑制剂、TRPA1特异拮抗剂(冷刺激组)和TRPV1特异拮抗剂(除冷刺激组)对理化刺激诱导气道血浆渗出的影响。结果1.与对照组相比,冷生理盐水、热生理盐水刺激食管引起气管、主支气管和细支气管血浆渗出,对照组各部位分别为:[(16.69±6.02)pg/mg、(11.59±2.45)pg/mg、(7.55±2.40)pg/mg];冷刺激组分别为:[(31.2±10.61)pg/mg、(18.82±5.11)pg/mg、(12.24±1.94)pg/mg, P均<0.05];热刺激组分别为[(54.02±13.51)pg/mg,P<0.001;(40.59±11.57)pg/mg, P<0.05; (28.31±10.03)pg/mg, P<0.05)]。2.与对照组相比,乙醇、盐酸刺激食管引起气管、主支气管和细支气管血浆渗出增加[乙醇组分别为(74.41±12.03)pg/mg、(73.37±13.69)pg/mg、(53.84±17.18)pg/mg, P均<0.001] ;盐酸组分别为[(42.80±13.41)pg/mg、(29.74±11.60)pg/mg、(16.77±5.58)pg/mg, P均<0.05 ];高渗溶液刺激组气道血浆渗出无显著变化(P >0.05)。3.加入Phosphoramidon后导致冷、热、盐酸、乙醇刺激诱导气道血浆渗出显著增多:冷刺激组分别为[(60.52±13.67)pg/mg、(34.56±7.52)pg/mg、(26.71±6.89)pg/mg;热刺激组分别为[(82.78±11.16)pg/mg、(59.32±7.35)pg/mg、(45.74±6.88)pg/mg,两组气管、主支气管P均<0.001,细支气管P< 0.05];盐酸刺激组分别为[(73.58±15.52)pg/mg、(63.67±21.32)pg/mg、(40.52±8.9)pg/mg, P均<0.05] ;乙醇刺激组分别为[气管(106.21±10.84)pg/mg和主支气管(106.56±10.85)pg/mg, P均<0.05]。4.加入HC-030031或Capsazepine后,冷、热和盐酸诱导的气管和主支气管血浆渗出减少:冷刺激组分别为[(19.62±5.50)pg/mg和(14.57±3.98)pg/mg,P均<0.01];热刺激组[(40.65±12.62)pg/mg和(29.18±10.79)pg/mg, P均<0.05];盐酸刺激组[(26.65±10.36)pg/mg和(63.67±21.32)pg/mg,P均<0.05]。细支气管P>0.05。乙醇+Capsazepine组与单纯乙醇组无差别(P>0.05)。5.各组肺泡灌洗液炎症细胞总数和分类均无显著差别(P均>0.05)。6.单纯冷刺激组与冷刺激联合阿托品和心得安组相比,气道血浆渗出无明显差异(P>0.05)。结论:豚鼠食管内不同理化溶液刺激可诱导气道血浆渗出;刺激效应可被神经内肽酶抑制剂Phosphoramidon显著增强。作用机制可能与TRPV1和TRPA1被激活有关。分题二灌注对气道P物质含量的影响目的:观察上述不同理化性质溶液刺激食管时气道P物质(SP)含量的变化,探讨刺激效应与神经源性炎症的关系。方法:动物模型同第一部分分题一,采用ELISA方法检测各组右主支气管的SP含量。结果1.与对照组相比,冷热刺激食管可诱导右主支气管SP含量增加[对照组(4.12±1.15)pg/mg,冷刺激组(6.79±1.11)pg/mg,热刺激组(12.71±3.03)pg/mg,两组P均<0.05]。2.与对照组相比,盐酸和乙醇刺激食管可引起右主支气管SP含量增加(盐酸刺激组:[(10.76±3.61)pg/mg,乙醇刺激组(19.98±7.84)pg/mg, P均<0.05];高渗刺激组右主支气管SP含量无显著变化(P>0.05)。2.加入Phosphoramidon后,冷、热、盐酸和乙醇刺激诱导的右主支气管SP含量显著增加[冷刺激组(11.71±4.0)pg/mg,热刺激组(16.82±3.17)pg/mg,盐酸刺激组(19.25±9.16)pg/mg,乙醇刺激组(28.26±3.94)pg/mg, P均<0.05]。3.加入HC-030031或Capsazepine后,冷、热、盐酸刺激组右主支气管SP含量减少[冷刺激组(4.32±1.05)pg/mg,热刺激组(9.49±1.73)pg/mg,盐酸刺激组(6.91±2.59)pg/mg,热刺激组:P<0.01;冷刺激和盐酸刺激组:P<0.05);乙醇刺激与单纯乙醇刺激组比较,SP含量无差别(P>0.05)。结论:冷热生理盐水,盐酸和乙醇灌注食管引起的气道血浆渗出增多,其作用机制可能与TRPV1,TRPA1被激活导致气道SP释放有关。第二部分豚鼠食管的温度化学感受器TRPV1、TRPA1和C纤维的分布目的:观察食管及神经节上温度化学感受器TRPV1、TRPA1和C纤维的分布和表达。方法:Hartlay白化豚鼠麻醉后取食管、结状神经节和脊神经节进行冰冻切片,应用荧光免疫染色结合激光共聚焦显微镜技术,观察TRPV1、TPRA1和C纤维在食管及神经来源的神经节上的表达和分布。结果:食管粘膜上皮有TRPA1强阳性表达;粘膜层、和血管周围可见TRPA1阳性神经表达。食管粘膜上皮细胞有SP少量表达;粘膜层和肌层可见SP免疫阳性纤维表达。食管粘膜层和血管周围可见TRPV1阳性神经表达。结状神经节和脊神经节可见TRPA1、TRPV1和SP阳性神经元表达。结论:豚鼠食管组织、结状神经节和脊神经节存在TRPA1、TRPV1和SP免疫阳性纤维。本研究小结:1.冷和热、酸和乙醇刺激豚鼠食管可诱导气道血浆渗出,该效应可被TRPA1拮抗剂(冷刺激)和TRPV1拮抗剂抑制,可被神经内肽酶抑制剂显著增强。2.上述不同理化性质溶液刺激食管可诱导气道SP含量增加,TRPA1和TRPV1拮抗剂可抑制刺激效应。3.豚鼠食管和神经节存在TRPA1,TRPV1和SP免疫阳性纤维。