构建人胎盘cDNA文库对于研究基因功能和发掘新基因具有重要意义,本研究利用SMART技术构建了人胎盘cDNA文库,并对文库质量进行鉴定;从文库中筛选人溶菌酶基因的全长序列并构建其原核和真核表达载体;同时,复苏已冻存的大白猪体外成纤维细胞,并进行各项生物学特性检测;观察转染HLYz重组质粒的大白猪成纤维细胞;对HLYz原核重组质粒进行SDS-PAGE和Western blot检测其目的蛋白的表达状况,为基因学和重组蛋白的研究提供了理论依据和技术基础,结果如下:1.采用TRIzol试剂提取人胎盘组织的总RNA,变性电泳检测可见28S和18S两条带,且28S与18S的亮度比为2:1,OD 260∕280值为2.01。以总RNA为模板,LD-PCR合成cDNA第二条链,电泳检测其为4Kb以下的一条脱影,双链cDNA经Sfi酶切后收集大片段并与λ噬菌体连接,包装后扩增得到人胎盘cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及插入片段大小进行分析,结果所建cDNA文库的容量约为1.36×l010 pfu/mL,重组率为97.6 %,平均插入片段为950 bp。2.以人胎盘cDNA文库为模板,筛选人溶菌酶基因HLYz,测序结果与Genbank进行比对,并采用双酶切法,构建其真核表达载体pEGFP-N3-H-LYz和原核表达载体pGEX-4T-1-H-LYz。3.采用贴壁培养法培养大白猪体外成纤维靶细胞,并进行各项生物学特性的检测。将pEGFP-N3-H-LYz质粒转染靶细胞,观察其在靶细胞中的表达和亚细胞定位状况,结果发现,转染24h、48h和72h后,荧光在细胞核与细胞质中均有分布,但主要集中在细胞核周围,转染率在10.3 %～33.2 %之间。将pGEX-4T-1-H-LYz质粒进行SDS-PAGE及Wester blot,检测目的蛋白的大小及表达情况,结果发现HLYz融合蛋白在细菌基因组中正常表达。