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糖尿病是一种世界性新兴的疾病,其发病率激增,预计在未来将会更迅速的增长。多数糖尿病患者伴有肥胖、脂肪肝及心脑血管疾病等并发症,这些并发症严重威胁人类的健康。研究表明,单一糖类消耗成为糖尿病发病的主要因素之一。因此,利用低血糖应答的甜味剂代替蔗糖成为预防糖尿病的有效方法。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向异构体,是一种己酮糖甜味剂,属于稀有糖。D-阿洛酮糖的甜度为蔗糖的70%,但其能量仅为蔗糖的0.3%,是食品中理想的代糖品。D-阿洛酮糖具有降低血糖、降低血脂、清除活性氧自由基和神经保护等重要的生理功能。在食品加工过程中,可改善凝胶特性并可产生良好的风味。D-阿洛酮糖在天然产品中存在较少,但生物催化新技术的开发使D-阿洛酮糖的大规模生产成为可能。D-塔格糖3-差向异构酶家族酶可催化醛酮糖C-3位的差向异构,从而实现D-果糖向D-阿洛酮糖的转化。D-塔格糖3-差向异构酶家族酶因其底物专一性的不同,被分为D-塔格糖3-差向异构酶(DTEase酶)和D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase酶)两类。本研究前期利用鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)ATCC BAA-613进行全细胞反应,确定该菌株具有催化D-果糖差向异构生成D-阿洛酮糖的能力,无副产物产生。在此基础上,对该鲍氏梭菌(C. bolteae)ATCC BAA-613全基因组中预测的DPEase酶基因进行克隆、表达;对DPEase酶进行分离纯化、酶学性质、构效关系及分子改造等方面进行研究;实现DPEase酶在食品级宿主枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中表达,并分别基于Cre/lox系统和反向筛选标记mazF基因,成功构建食品级表达系统。具体包括以下几部分内容:1.利用PCR的方法扩增获得C. bolteae ATCC BAA-613的DPEase的基因序列,利用pET-22b(+)表达载体,构建重组质粒,转化表达宿主Escherichia. coli BL21(DE3),成功构建重组菌株E. coli BL21/pET-22b(+)-CLOBOL00069。2.对重组菌株E. coli BL21/pET-22b(+)-CLOBOL00069的诱导表达条件进行研究。结果表明在对数生长中期OD值为1.0左右后,加入终浓度为5g/L的乳糖,20°C条件下诱导7h,可达到最大酶活,为6.1U/mL发酵液。利用重组菌株E. coliBL21/pET-22b(+)-CLOBOL00069全细胞进行转化。经鉴定,产物为D-阿洛酮糖,说明C. bolteae ATCC BAA-613的DPEase基因在E. coli BL21中表达正确并具有转化D-果糖为D-阿洛酮糖的能力。3.利用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱和Superdex20010/300GL凝胶柱对C. bolteae DPEase酶进行分离纯化,其亚基分子量约为34kDa,酶蛋白分子量为139kDa,证实来源于C. bolteae的DPEase酶为四聚体酶。C. bolteae DPEase酶是金属蛋白酶,Mn2+和Co2+可显著增强酶活。当Co2+浓度为0.4mmol/L时,C. bolteae DPEase酶获得最大酶活。4. C. bolteae DPEase酶的最适反应pH为7.0,在pH6.57.5之间其相对酶活较高,表现出良好的活性。最适反应温度为55°C,在45°C以下,该酶较稳定,当温度大于50°C时,酶的热稳定性较差。在Co2+存在的情况下,酶的热稳定性显著提高。55°C时,Co2+的添加可使酶的半衰期延长至原来的3.6倍。5.研究C. bolteae DPEase酶的底物特异性,发现该酶对D-阿洛酮糖的底物特异性最高,D-果糖次之,其次为D-塔格糖,而对磷酸化的糖基本没有作用。并测定该酶的动力学常数,当以D-阿洛酮糖作为底物时,其Km、kcat和kcat/Km分别为27.4mM、2935min-1和107.1min-1mM-1。该酶对D-阿洛酮糖的Km值远小于其他底物,催化效率kcat/Km较其他底物更大,其说明其对D-阿洛酮糖的亲和性更高,其最适底物是D-阿洛酮糖。因此该酶被鉴定为D-阿洛酮糖3-差向异构酶。6.利用已有的晶体结构信息,利用SWISS-MODEL对C. bolteae DPEase酶单体的结构进行模拟,利用Discovery studio软件对C. bolteae DPEase酶和D-果糖进行对接,获得位于活性中心的关键氨基酸位点为Glu158,His188,Arg217,Glu152,Glu246,Y68和G109。突变结果表明,Glu152和Glu246为催化活性中心关键氨基酸,Glu158,His188和Arg217与底物结合有关,68和109位的氨基酸与底物识别有关,影响活性口袋的形成。并成功构建双突变体Y68I/G109P,该突变体酶对D-果糖的亲和能力更高,具有更好的热稳定性。7.利用B. subtilis WB800对C. bolteae DPEase酶进行表达,成功构建重组菌株B.subtilis WB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。该重组菌株无需诱导即可产生DPEase酶,18h时酶活可达到6.8U/mL。该酶最适pH为7.0,最适温度为60°C,与E. coli表达的DPEase酶酶学性质相似。结果表明,DPEase酶可在B. subtilis中的表达。8.利用Cre/lox系统成功构建食品级重组菌株B. Subtilis/lox-DPE,获得的最高酶活可达6.5U/mL发酵液(B. subtilis1A751/lox-DPE)。其OD600值可达12左右,远高于重组菌B. subtilis WB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。在启动子P43的作用下,C. bolteaeDPEase酶基因在对数期及稳定期均可高效迅速的表达。9.利用mazF基因作为反向筛选标记,成功构建食品级重组菌株B. subtilis/DPE,获得最高酶活可达6.4U/mL发酵液(B. subtilis1A751/DPE),与重组菌B. subtilis/lox-DPE和重组菌B. subtilis WB800/pMA5-cbdpe的最高酶活相差不大。其OD600值可达12左右,与重组菌B. subtilis/lox-DPE相同,远高于重组菌B. subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。