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研究背景和目的：深静脉血栓形成(DVT)常发生于骨科大手术后，其继发肺栓塞严重威胁患者生命。迄今为止，尚缺乏早期诊断的实验室指标。近年来发现外泌体及其包含的miRNA和特异性蛋白可作为各种疾病诊断指标和药物作用靶点为诊断DVT提供了新的思路。本实验旨在通过蛋白质组学分析方法检测DVT患者血浆外泌体中蛋白质，探索具有DVT早期诊断潜能的外泌体特异蛋白质分子，通过动物实验检测该外泌体特异蛋白质在损伤血管处的表达及其与血管组织损伤的关系；细胞实验进一步证实了外泌体对血管内皮细胞的作用。探索外泌体在DVT早期诊断中的价值。
方法：(1)用差速离心法从DVT患者(n=4)和健康志愿者对照组血浆中提取外泌体，对外泌体进行蛋白质组学分析。(2)结扎下腔静脉建立大鼠静脉血栓形成模型。对照组为实验大鼠实施开腹手术而不结扎下腔静脉，实验动物组为大鼠下腔静脉结扎1天(IVCL-1D)、3天(IVCL-3D)、7天(IVCL-7D)。分离各组大鼠血浆外泌体，用透射电镜和纳米颗粒跟踪分析进行鉴定。用TUNEL法和HE染色检测大鼠血栓段内皮细胞。Westernblotting检测各组血管MPO、ALIX、GAPDH、TSG101、CD63蛋白的表达。采用免疫荧光法检测损伤血管内的MPO分布与表达。(3)培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。用PKH67荧光染料标记外泌体，与人脐静脉内皮细胞共培养，观察外泌体与HUVECs相互作用。用CCK8法测定外泌体对细胞增值影响。
结果：(1)蛋白质组学分析发现DVT患者血浆中存在外泌体差异蛋白，对这些差异蛋白进行生物信息学分析，选取髓过氧化物酶(MPO)作为目标差异蛋白。(2)血栓形成的动物模型中，在IVCL-1D组和IVCL-3D组，血栓形成部位血管内皮细胞损伤、凋亡，并且在IVCL-3D组最为明显，在IVCL-7D组已经基本恢复。差异蛋白髓过氧化物酶(MPO)在IVCL-1D、IVCL-3D组于血管上分布明显增多，而在IVCL-7D组较少表达。(3)外泌体与HUVECs共培养中，从IVCL-1D组和IVCL-3D组提取血浆外泌体对HUVECs加重损伤和促进凋亡作用，尤其IVCL-3D组损伤、凋亡作用最明显，然而IVCL-7D并无明显作用。MPO在IVCL-1D、IVCL-3D组中的血浆外泌体含量明显增高，而在IVCL-7D组含量较少。
结论：血栓形成血浆外泌体对血管内皮细胞具有损伤作用，在血管损伤早期，外泌体中MPO增高可以作为血管早期损伤的生物标记物，血浆外泌体具有作为DVT形成早期的生物标记物的潜能。
方法：(1)用差速离心法从DVT患者(n=4)和健康志愿者对照组血浆中提取外泌体，对外泌体进行蛋白质组学分析。(2)结扎下腔静脉建立大鼠静脉血栓形成模型。对照组为实验大鼠实施开腹手术而不结扎下腔静脉，实验动物组为大鼠下腔静脉结扎1天(IVCL-1D)、3天(IVCL-3D)、7天(IVCL-7D)。分离各组大鼠血浆外泌体，用透射电镜和纳米颗粒跟踪分析进行鉴定。用TUNEL法和HE染色检测大鼠血栓段内皮细胞。Westernblotting检测各组血管MPO、ALIX、GAPDH、TSG101、CD63蛋白的表达。采用免疫荧光法检测损伤血管内的MPO分布与表达。(3)培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。用PKH67荧光染料标记外泌体，与人脐静脉内皮细胞共培养，观察外泌体与HUVECs相互作用。用CCK8法测定外泌体对细胞增值影响。
结果：(1)蛋白质组学分析发现DVT患者血浆中存在外泌体差异蛋白，对这些差异蛋白进行生物信息学分析，选取髓过氧化物酶(MPO)作为目标差异蛋白。(2)血栓形成的动物模型中，在IVCL-1D组和IVCL-3D组，血栓形成部位血管内皮细胞损伤、凋亡，并且在IVCL-3D组最为明显，在IVCL-7D组已经基本恢复。差异蛋白髓过氧化物酶(MPO)在IVCL-1D、IVCL-3D组于血管上分布明显增多，而在IVCL-7D组较少表达。(3)外泌体与HUVECs共培养中，从IVCL-1D组和IVCL-3D组提取血浆外泌体对HUVECs加重损伤和促进凋亡作用，尤其IVCL-3D组损伤、凋亡作用最明显，然而IVCL-7D并无明显作用。MPO在IVCL-1D、IVCL-3D组中的血浆外泌体含量明显增高，而在IVCL-7D组含量较少。
结论：血栓形成血浆外泌体对血管内皮细胞具有损伤作用，在血管损伤早期，外泌体中MPO增高可以作为血管早期损伤的生物标记物，血浆外泌体具有作为DVT形成早期的生物标记物的潜能。