论文部分内容阅读
背景及目的食管癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国分别位居恶性肿瘤的第五位和第四位。食管鳞状细胞癌（食管鳞癌）是食管癌的主要病理类型之一，在我国的中西部地区，食管鳞癌约占整个食管癌病理类型的90%。食管癌的发病机制仍然不清，但是，越来越多的研究表明，遗传学（基因突变、杂合子丢失、纯合子缺失等）和表观遗传学（DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印迹、非编码RNA等）的改变在食管癌发生、发展中起重要作用。DACH1是视网膜决定基因网络的重要组份，存在于多种上皮细胞中。DACH1在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、子宫内膜癌和肝细胞癌等肿瘤中表达降低，并且与患者不良预后相关。DACH1在子宫内膜癌、结肠癌和肝细胞癌中的表达受基因启动子区甲基化调控。此外，在肝细胞癌中，DACH1可以通过激活TGF-β信号通路发挥抑癌作用。本研究旨在探讨DACH1在食管鳞癌中的表观遗传学改变、作用及其机制。方法采用半定量RT-PCR方法检测去甲基化药物5-aza-2’-deoxycytidine（5-AZA）处理前后，11株食管鳞癌细胞系中DACH1mRNA的表达水平；采用甲基化特异性PCR方法检测11株食管鳞癌细胞系、10例正常食管黏膜、51例食管不典型增生以及104例原发性食管鳞癌组织样本中DACH1启动子区的甲基化状态；采用免疫组化方法检测30例食管鳞癌组织和配对的癌旁组织样本中DACH1的表达水平，并分析DACH1表达水平与基因启动子区甲基化之间的关系；采用流式细胞技术、克隆形成实验以及裸鼠移植瘤模型，探讨DACH1在食管癌中的生物学功能；采用双荧光素酶报告基因系统，在DACH1低表达的食管鳞癌细胞系中检测DACH1对TGF-β信号通路的影响；采用重组DACH1慢病毒感染或siRNA沉默的方法分别处理DACH1低表达或高表达的食管鳞癌细胞系，运用Western Blot方法检测DACH1对TGF-β信号通路下游蛋白表达的影响。结果DACH1在KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE180、KYSE450和KYSE410细胞系中表达，在TE8细胞系中表达降低，而在KYSE150、KYSE510、TE1和TE3细胞系中表达缺失。KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE180、KYSE450和KYSE410中DACH1启动子区呈非甲基化状态，TE8中DACH1启动子区呈部分甲基化状态，而KYSE150、KYSE510、TE1和TE3中DACH1启动子区呈完全甲基化状态。去甲基化药物5-AZA处理后可以恢复KYSE150、KYSE510、TE1和TE3细胞系DACH1mRNA表达。在18.8%（6/32）的食管轻度不典型增生、42.1%(8/19)的中重度不典型增生以及61.5%（64/104）的原发性食管鳞癌组织样本中检测到DACH1启动子区高甲基化改变，而在10例正常食管黏膜中均未发现DACH1启动子区甲基化改变。DACH1启动子区甲基化频率随着食管癌变的进展呈现累积性改变（P <0.01），并且DACH1甲基化与食管鳞癌组织低分化（P <0.05）和肿瘤晚期（P <0.05）相关。在食管鳞癌细胞系KYSE150和KYSE510中，恢复DACH1表达可以激活TGF-β信号通路并抑制细胞增殖和克隆形成。恢复DACH1表达可以抑制KYSE150和KYSE510细胞裸鼠移植瘤的生长。结论DACH1在食管鳞癌中频繁发生启动子区甲基化，并且DACH1启动子区甲基化是食管癌变过程中的早期事件。食管鳞癌中，DACH1的表达受启动子区甲基化的调控。DACH1通过激活TGF-β信号通路发挥抑制食管癌生长的作用。