背景与目的:胎盘植入（Placenta Accreta Spectrum,PAS）被定义为胎盘部位的滋养细胞不同程度的穿透入子宫肌层。PAS作为产科最严重的并发症之一,其常导致出血并引发多器官衰竭,弥漫性血管内凝血,子宫切除,甚至死亡等严重并发症。虽然许多研究已经针对PAS危险因素进行了描述,但目前有关植入如何发生发展仍不清楚,并且临床上缺乏可靠血清学标志物诊断PAS。胎盘植入发生的相关学说主要包括:滋养细胞过度浸润,蜕膜缺损以及母体血管生成异常。人肺腺癌转移相关转录本1（metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1,MALAT1）是定位在人类11q13染色体上,长约8700bp的长链非编码RNA。在肿瘤细胞中,MALAT1的表达增加与血管生成、细胞增殖及侵袭等多种表型密切相关,而其影响血管生成及细胞浸润的表型与胎盘植入的假说相吻合。本课题组通过转录组学测序结果发现,MALAT1在胎盘植入患者的胎盘组织中显著性高表达,说明MALAT1可能对胎盘植入发生发展起重要作用。随后我们通过进一步的生物信息学分析预测后得到了同样在测序结果中显著性低表达并与MALAT1存在结合位点的miR-216a-5p及显著性高表达并与miR-216a-5p存在结合性位点的HK2。而这三者是否对胎盘植入发生发展产生了影响及其三者之间的调控关系尚不清楚。本课题的主要目的是深入揭示Lnc RNA MALAT1/miR-216-5p/HK2轴在胎盘植入发生发展中可能发挥的重要作用。进一步研究MALAT1/miR-216a-5p/HK2三者之间的调控关系,并明确三者参与到胎盘植入发生发展之中的机制,如滋养细胞过度浸润及血管生成异常。从而为胎盘植入的治疗提供新的临床靶点及分子标记物。研究方法:第一部分:利用课题组前期通过高通量测序检测10例胎盘植入患者及10例对照组患者得到的数据进行lnc RNAs差异表达的生物信息学分析,根据差异表达倍数及P值选取了30个表达差异最显著的lnc RNA。而通过查阅文献,我们发现了其中可能通过影响细胞侵袭和血管生成能力从而在胎盘植入中发生作用的MALAT1。随后我们在胎盘植入及对照组患者的胎盘组织中验证了MALAT1的表达,并在HTR-8/SVneo及SWAN-71滋养细胞系中过表达及敲减MALAT1,通过real-time PCR、CCK-8、EDu、划痕实验、Transwell小室实验、Annexin V-FITC/PI凋亡检测实验、细胞周期实验及血管生成实验体外验证了MALAT1对滋养细胞生物学功能起到的影响。第二部分:依据“ce RNA”学说,我们对前期高通量测序的数据进行了miRNAs差异表达的生物信息学分析。根据差异表达倍数及与MALAT1的结合位点预测结果,我们筛选出了在测序胎盘植入组织中呈显著性低表达的miR-216a-5p并继续通过Real-time PCR验证了其在胎盘植入组织中的低表达。随后,我们利用双荧光素酶报告基因实验验证了MALAT1与miR-216a-5p的靶向结合。在本部分的最后,我们在滋养细胞系中过表达及敲减了miR-216a-5p并利用real-time PCR检测了转染效率,之后我们继续利用CCK-8、EDu、划痕实验、Transwell小室实验、Annexin V-FITC/PI凋亡检测实验、细胞周期实验及血管生成实验体外验证了miR-216a-5p对滋养细胞生物学功能起到的影响。第三部分:为了寻找miR-216a-5p可能的作用靶点,我们利用前期高通量测序的数据进行了蛋白质组学和转录组学的联合分析,从中筛选出了23个同向差异表达的中枢基因。之后我们进一步利用生物信息学网站预测出了其中与miR-216a-5p存在结合位点的己糖激酶2（hexokinase2,HK2）,并继续通过Real-time PCR及Western blot实验验证了其在胎盘植入组织中的高表达。随后,我们利用双荧光素酶报告基因实验验证了miR-216a-5p与HK2的靶向结合。在本部分的细胞实验中,我们首先利用Real-time PCR及Western blot检测了HK2的敲减及过表达效率,并随后通过一系列功能学实验验证了HK2对滋养细胞生物学功能的影响。最后我们进行了两部分共转染的实验,包括（1）共转染HK2过表达质粒+miR-216a-5p mimic组与质粒NC组+miR-216a-5p mimic组进行比较;（2）共转染MALAT1敲减+miR-216a-5p inhibitor组与MALAT1敲减+inhibitor NC组进行比较。而通过这两部分实验,我们拟验证lnc RNA MALAT1是否可以负性调节miR-216a-5p并靶向HK2影响滋养细胞生物学行为的功能。第四部分:我们通过在普通大鼠中进行孕前手术以建立胎盘植入的模型,并于孕16天完成取材。随后我们进行了成模与否的评估,具体包括HE染色观察胎盘与肌层细胞的形态并采用免疫组化法分析角蛋白8在植入组与非植入组的表达及滋养细胞的侵袭深度。最后我们采用免疫组化法检测了两组大鼠胎盘组织中HK2的表达,并利用q RT-PCR法验证了两组大鼠胎盘中Lnc RNA MALAT1/miR-216a-5p/HK2的表达。结果:第一部分:在对高通量测序的结果进行lnc RNAs的差异分析后,我们一共发现了261个存在显著表达差异的lnc RNA,其中包括显著性下调154个及显著性上调107个。随后我们根据差异表达倍数筛选出了表达差异最明显的30个lnc RNA。而通过进一步查阅文献,我们选择了可能通过影响细胞侵袭及血管生成的MALAT1作为我们后续研究的lnc RNA,并在组织中验证了其在胎盘植入胎盘组织中的显著性高表达。在进行进一步的细胞实验之前,我们首先检测了四个滋养细胞系中MALAT1的表达,结果显示HTR-8/SVneo及SWAN-71细胞系中常态表达MALAT1的量显著高于JEG3及Be Wo细胞系,因此我们选择HTR-8/SVneo及SWAN-71细胞进行后续的实验。之后的体外实验显示,在HTR-8/SVneo及SWAN-71滋养细胞中分别过表达和敲减Lnc RNA MALAT1后,发现沉默MALAT1抑制胎盘滋养细胞的增殖、迁移和侵袭、促进细胞周期阻滞,胎盘滋养细胞凋亡;过表达MALAT1促进胎盘滋养细胞的增殖、迁移和侵袭、抑制细胞周期阻滞,胎盘滋养细胞凋亡。这部分实验结果表明lnc RNA MALAT1在胎盘植入中显著性高表达,并可以通过影响细胞的侵袭及血管生成等功能促进胎盘植入的发生发展。第二部分:根据对前期高通量测序结果的分析,我们找到了在胎盘植入组及对照组胎盘组织中显著性差异表达的71个miRNA,其中包括表达上调的miRNA32个及下调的39个。随后我们继续利用了Starbase数据库,在这些差异表达的miRNA中找到了与MALAT1存在结合位点的miR-216a-5p,并利用real-time PCR实验验证了其在胎盘植入组织中的低表达。双荧光素酶报告基因结果显示MALAT1可以靶向结合miR-216a-5p。进一步的细胞实验结果显示,过表达miR-216a-5p抑制胎盘滋养细胞的增殖、迁移和侵袭、促进细胞周期阻滞,胎盘滋养细胞凋亡;沉默miR-216a-5p促进胎盘滋养细胞的增殖、迁移和侵袭、抑制细胞周期阻滞,胎盘滋养细胞凋亡。这一部分的结果显示在胎盘植入组中低表达的miR-216a-5p可以通过影响细胞的侵袭及血管生成等功能抑制胎盘植入的发生发展。第三部分:我们对高通量测序的结果进行转录组学和蛋白质组学的联合分析,结果显示33个基因在转录组学和蛋白质组学中同时存在差异表达,而23个基因在两个组学中的表达为同向。我们继续根据Starbase数据库,在这些具有同向差异的中枢基因中找到了与miR-216a-5p存在结合位点的己糖激酶2（hexokinase2,HK2）。双荧光素酶报告基因结果显示miR-216a-5p可以靶向结合HK2。进一步的细胞实验结果显示,沉默HK2抑制胎盘滋养细胞的增殖、迁移和侵袭、促进细胞周期阻滞,胎盘滋养细胞凋亡;过表达HK2促进胎盘滋养细胞的增殖、迁移和侵袭、抑制细胞周期阻滞,胎盘滋养细胞凋亡。而在两组共转染的实验中我们发现miR-216a-5p的敲减逆转了Lnc RNA MALAT1水平降低对细胞增殖,侵袭,迁移和血管生成的抑制作用,此外还降低了细胞凋亡率和促进了细胞周期在G0/G1期的停滞。而HK2的过表达逆转了MIMIC对细胞增殖,侵袭,迁移和血管生成的抑制作用,此外还减少了细胞凋亡率和细胞周期在G0/G1期的停滞。在本部分中,我们证实了miR-216a-5p可以靶向结合HK2及HK2对滋养细胞生物学行为的影响。而通过共转染实验,我们证实了lnc RNA MALAT1可以作为“分子海绵”调控miR-216a-5p靶向HK2影响滋养细胞的一系列生物学行为。第四部分:通过HE染色确定子宫环形平滑肌的破坏及角蛋白8免疫组织化学染色确定滋养细胞的侵袭深度,我们发现在35只接受孕前手术的大鼠中一共有6只出现了胎盘植入的表型,大鼠胎盘植入的建模成功率为17.14%。而通过成功构建大鼠胎盘植入模型,我们进一步的对胎盘植入组及对照组大鼠胎盘组织进行了HK2的免疫组织化学染色,结果显示HK2在胎盘植入组的表达显著升高。最后我们利用Real-time PCR在胎盘植入组大鼠的胎盘组织中验证了三者的表达趋势,即Lnc RNA MALAT1及HK2在胎盘植入组中显著性高表达,而miR-216a-5p则呈显著性低表达。结论:胎盘植入患者的胎盘组织中MALAT1及HK2表达上调,miR-216a-5p表达下调。Lnc RNA MALAT1及miR-216-5p及HK2的表达变化会显著影响滋养细胞的生物学行为。Lnc RNA MALAT1通过与miR-216a-5p结合调控HK2的表达来调节滋养细胞的生物学行为从而影响胎盘植入的发生发展。本研究通过探索Lnc RNA MALAT1/miR-216-5p/HK2轴对滋养细胞浸润功能的调控机制,挖掘HK2与胎盘植入疾病的内在关联性,为胎盘植入的发病机制提供实验基础,使HK2与miR-216a-5p可能作为新的靶标为疾病早期预测和诊疗提供新的思路及切入点。