背景及意义眼外伤在临床上极为常见。角膜创伤愈合后，常遗留瘢痕而形成角膜散光，影响视功能的恢复和美观，严重者可形成框架镜或准分子激光手术等亦难以矫正的屈光参差。一个多世纪以来，通过手术矫正散光以获得良好的裸眼视力，一直是眼科医师们不懈努力的方向和屈光手术关注的课题，并对散光手术进行着多样化的尝试，不断地进行着技术改进和创新，虽然都取得了一定的疗效，但也存在有一定的局限性和不足。尤其是对外伤性角膜散光的手术矫治尚未见有关的文献报道。本研究从基础和临床两部分入手探索外伤性角膜散光的防治措施。基础部分：在角膜损伤后愈合过程的早期，通过药物干预减少瘢痕形成从而降低角膜散光；临床部分：在角膜愈合瘢痕形成稳定后3个月，通过手术矫正将角膜散光降低到可控制的范围，即可以通过框架镜或准分子激光手术等来矫正，以改善患者的裸眼视力，将眼外伤对视功能造成的损害减少至最低限度。第一部分TGF-β₂反义寡核苷酸对兔角膜损伤修复的影响目的研究表明转化生长因子—beta（Transforming growth factor-β₂，TGF-β）在机体伤口愈合过程中起到重要的调节作用，其中TGF-β₂是角膜创伤修复的启动因子，通过调控TGF—β₂的活性可调控角膜创伤的修复过程。本实验采用实验动物兔制作角膜穿孔伤模型，设计应用TGF-β₂的反义寡核苷酸（TGF-β₂antisense oligonucleotide，TGF-β₂ ASON）转染角膜外伤缝合术后的瘢痕组织，然后通过裂隙灯观察、HE染色、免疫组化和荧光定量PCR等检测方法，从大体形态、组织结构、蛋白数量及基因水平等不同层面观察分析TGF-β₂反义寡核苷酸对TGF-β₂的活性的影响，为实现药物干预减少瘢痕形成以控制外伤性角膜散光的设想提供理论依据。方法1．TGF-β₂反义寡核苷酸（anti-sense oligodeoxynucleotide，ASON）的制备：根据兔TGF-β₂ mRNA序列（Gene bank号AY429466），由上海生工生物技术有限公司合成一段21bp的ASON，其序列为5′-AGAAGTTGGCATTATACCCTT-3′，并合成一段错义寡核苷酸（missense oligodeoxynucleotide，MSON）作为对照。2．选用清洁级健康无眼病的新西兰大白兔24只，雌雄兼用，月龄为3个月。随机分组：实验组16只，双眼均制备角膜穿孔伤缝合术后模型。左眼术后滴TGF-β₂ ASON，为TGF-β₂ ASON组；右眼滴生理盐水，为生理盐水组；对照组8只，不做手术，同样左眼滴TGF-β₂ ASON，右眼滴生理盐水。两组分别于手术后4、7、14、28天取角膜标本，每次6只，实验组4只，对照组2只。3．观察指标：应用裂隙灯观察角膜瘢痕组织的形态变化；HE染色观察角膜基质细胞，即成纤维细胞的激活、增生、分化情况；免疫组织化学法（SP法）检测α-SMA及纤维连接蛋白（FN）的染色情况；应用实时荧光定量PCR观察TGF-β₂的mRNA表达情况，评价TGF-β₂反义寡核苷酸对角膜创伤修复过程的影响及毒副作用。结果1．裂隙灯观察TGF-β₂ ASON组：球结膜轻度充血，角膜缝线附近水肿，前房闪辉（0～+），虹膜纹理清晰，瞳孔圆居中，眼压正常。随着时间的延长，眼前段炎症反应逐渐减轻，至术后1周完全消失。生理盐水组：角膜明显水肿，前房闪辉（+～++），虹膜纹理不清晰，瞳孔欠圆，眼压正常，角膜缘同时期出现大量新生血管。随着时间的延长，眼前段炎症逐渐减轻，至术后2周完全消失，但角膜缘新生血管未消退。2．HE染色组织病理学观察TGF-β₂ ASON组：术后4d上皮细胞生长1～2层，基质层成纤维细胞体积增大，扁平，数量增多，平均每个高倍镜下9个染色细胞；术后7d，上皮增生4～5层，排列不规则，基质层成纤维细胞数目增多，平均每个高倍镜下12个染色细胞；术后14d，上皮基本趋于完整，基质层成纤维细胞数量少；胶原纤维排列疏松。生理盐水组：术后4d上皮细胞生长4～6层，基质层成纤维细胞体积增大，扁平，数量增多，平均每个高倍镜下21个染色细胞；术后7d，上皮增生4～5层，排列不规则，基质层成纤维细胞数目增多，平均每个高倍镜下18个染色细胞；术后14d，上皮层排列稍有些不规则，基质层成纤维细胞数量增生；胶原纤维排列致密紊乱。同时期两组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。对照组：滴TGF-β₂ ASON的和滴生理盐水的兔角膜组织高倍镜下表现一致。表现为上皮4—5层，基质层中偶有细胞，扁平；基质疏松。说明TGF-β₂ ASON对正常角膜无毒副作用。3．免疫组化观察（1） TGF-β₂ ASON组：α-SMA染色阳性的成纤维细胞数于术后7d达到高峰，术后14d回到基线水平已检测不到；生理盐水组：α-SMA染色阳性的成纤维细胞数于术后4d达到高峰，以后逐渐减少，术后14d尚有少许α-SMA阳性的成纤维细胞。两组均随着造模时间的延长，α-SMA染色阳性的成纤维细胞数逐渐减少；并且在术后4d和7d TGF-β₂ ASON组的α-SMA阳性的成纤维细胞数均比生理盐水组少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。（2） FN：可见TGF-β₂ ASON组FN染色明显减弱，呈板层散在分布于角膜伤口周围的基质层内；生理盐水组FN呈浓密板层分布于伤口周围的基质层内。4．实时荧光定量PCR的检测结果TGF-β₂ ASON组：兔角膜组织中TGF-β₂的mRNA于术后4d、7d、14d、28d相对表达量均明显减少，分别为0.0851±0.0028、0.1389±0.0079、0.0753±0.0026、0.0658±0.0007；与同时期生理盐水组：TGF-β₂的mRNA于术后4d、7d、14d、28d相对表达量分别为0.1943±0.0094、0.1915±0.0101、0.1623±0.0090、0.1318±0.0134比较，差异均具有统计学意义(p＜0.05=。结论1．TGF-β₂ ASON可特异性的阻断TGF-β₂的转录和翻译，从基因水平抑制TGF-β₂ mRNA的合成并影响TGF-β₂活性，从而调控角膜损伤修复的愈合过程。即抑制成纤维细胞的活化增生、胶原和纤维连接蛋白等ECM的堆积，从而发挥抗瘢痕化的作用。2．角膜损伤缝合术后成纤维细胞移行、增生最活跃的时期是术后4 d～7 d，TGF-β₂反义寡核苷酸对α-SMA阳性的成纤维细胞数明显的抑制作用也是在术后的14天以内。在角膜损伤修复这个动态级联过程的早期，即术后14 d内进行干预调控是减少术后瘢痕形成的关键。3．实时荧光定量RT-PCR对于检测兔角膜这样微量标本的基因表达是一个切实可行的技术，具有特异性高、定量准确、结果可靠及可重复性强等优点。第二部分外伤性角膜散光规律的及手术矫正的探讨目的本研究分两部分，第一部分拟通过对外伤性角膜散光规律的分析，找出角膜瘢痕与散光之间的相关关系；第二部分，对手术矫正散光的方法、术前手术量的设计与计算、手术效果的预测等进行系统研究，为散光的手术矫治提供理论依据。一、外伤性角膜散光规律的探讨方法收集30例外伤性角膜散光患者，接受裂隙灯下角膜摄像、角膜地形图的检测，电脑及检影验光（35岁以下患者麻痹睫状肌）。精确测量并记录瘢痕的形状长度及与角膜缘的位置关系、散光度及其轴向。将上述患者的资料与数据对比列表，进行相关分析和回归分析，探讨角膜瘢痕的长度与散光度之间的相关性。对瘢痕所致的角膜散光进行定性和定量的研究。结果1．相关分析结果显示：瘢痕长度（mm）与散光度（D）的相关系数为0.563，P值0.00＜0.01，说瘢痕长度与散光度数之间有相关性。进一步以Y（散光度）为因变量，X（瘢痕长度）为自变量进行线性回归分析，求得直线回归方程为：Y=1.703+0.478X。方程模型的假设检验：F=13.023，P=0.001，有统计学意义，说明瘢痕长度与散光度之间呈正相关关系，即瘢痕每改变1mm，散光度将会增加0.478D。（2）角膜瘢痕的形状、长度及部位与所引起的散光类型有关：①平行于角膜缘切线方向的横形瘢痕，引起与瘢痕长轴相垂直的角膜经线变陡峭，形成近视散光。②垂直于角膜缘切线方向的纵形瘢痕：引起与瘢痕长轴相平行的角膜经线变平坦，形成远视散光。二、外伤性角膜散光手术矫正的探讨方法随机收集角膜穿孔伤缝线拆除后3个月以上的外伤性角膜散光患者22例（22眼），其中单纯近视散光6例，复性近视散光4例，复性远视散光2例，混合性散光10例，所有病例角膜散光度数均＞2.5D，瘢痕长度≥4mm。1．术前检查：常规的裂隙灯眼前节检查和检眼镜眼底检查，测量眼压，电脑和检影验光（35岁以下的患者麻痹睫状肌）：检测裸眼视力、矫正视力、散光度及其轴向。角膜地形图检查：分析角膜陡峭经线和平坦经线。对比敏感度、立体视觉和波阵面像差的相关检查。2．手术设计及原理（1）切口位置及形状：为了最大限度保存透明角膜，切口设计做在角膜平坦经线上，角膜缘灰白交线前0.5～1.0mm处，平行于角膜缘做一对对称的弧行楔形切除，长度达90°弧度，深度达3／4角膜厚度。通过楔形切除+牵张缝线使平坦的经线变陡峭，矫正远视散光。同时，还可通过“偶联效应”使与其垂直的陡峭经线变平坦，矫正近视散光。（2）手术量的计算：据Gullstrand模型眼，将眼球看成一个近似圆球，推导出角膜缘楔形切除宽度的计算公式：D_V=（n′-n）/（r-x/π）-D_A（3）手术矫正量的设计：根据散光矫正的“偶联效应”，术中楔形切除的宽度应以所需矫正散光量的三分之二来设计，即按拟矫正散光量的2／3来设计楔形切除的宽度。（4）术后屈光状态的预测：在计算散光矫正手术量时，应预测患眼术后的屈光状态，是否与健眼的屈光状态相一致，力争恢复舒适而满意的视觉效果。3．手术方法依据角膜地形图、验光数据及术前设计的手术量标记散光轴向、切口的位置和长度、楔形切除的宽度，用锋利的刀片或单刃金刚石刀沿标记线做一对平行于角膜缘的楔形切除，长90弧度，切口深达3／4角膜厚度。用10～0聚丙稀缝线间断缝合切口并埋藏线结。术中用Placidou氏角膜计适时调整缝线的松紧度。结果1．术后屈光状态的改变：本组术前平均散光度为5.13±1.85D，术后平均散光度为1.42±0.22 D，平均下降3.71D，两者差异有统计学意义（P＜0.001）；残余散光度均在2.0D以内，散光轴变化在5°～10°，随访3个月疗效稳定，散光度波动在0.5 D～1D范围内。2．术后视功能的改变（1）术后视力：本组22眼平均裸眼视力术前为0.23±0.12，术后为0.62±0.26，矫正视力术前为0.8±0.25，术后为0.94±0.18，较术前有不同程度的提高，差异具有统计学意义（P＜0.001）。（2）术后OrbScan-Ⅱ检测：术后3个月复查OrbScan-Ⅱ，模拟角膜镜读数（simulated keratoscope reading，SimK），由术前的45.03±2.16D改变为43.75±1.98D，接近与正常的43.05±1.20D；术后角膜表面地形情况明显改善，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（3）术后对比敏感度的检查：术后1个月与术前相比无明显差异，术后3个月与术前相比，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（4）术后立体视的检查：与术前400″～200″组有17人（占77.3％）相比，术后3个月时仅剩8人（36.4％）；术后3个月超过60％的患者立体视在100″以内，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（5）术后波阵面相差的检查：因瘢痕造成角膜屈光界面发生较大畸变，大多数患者无法测出结果，故未进行统计学处理。结论1．外伤性角膜瘢痕的形状与散光的类型有一定的关系，平行于角膜缘切线方向的横形瘢痕，引起与瘢痕长轴垂直经线的近视散光；垂直于角膜缘切线方向的纵形瘢痕，引起与瘢痕长轴平行经线的远视散光。2．瘢痕长度与散光度呈正相关关系。即瘢痕每改变1mm，散光度将会增加0.478D。3．角膜缘对称楔形切除+牵张缝线术，矫正外伤性角膜散光是一种安全有效的、简便易行的手术方法，适用于矫正+4.00D以下的远视散光和混合性散光，及—2.00D以下的近视散光。与透明角膜的松弛性切开术相比，具有保存透明角膜、手术损伤轻、疗效稳定、可预测性强、切口愈合快、并发症少等优点。4．根据Gullstrand模型眼，将眼球看成一个近似圆球，推导出角膜缘楔形切除量的计算公式，通过计算分析发现：角膜缘楔形切除的量与散光矫正的量之间存在非线性相关关系，增强了手术的安全性和可预测性。但其准确性和应用前景，尚待在今后的研究中进一步加以验证。