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P2X受体是ATP激活的非选择性阳离子通道。当结合有ATP后,通道打开,Na+和Ca2+由胞外进入胞内。有功能的受体由三个亚基组成。根据已有的关闭状态和开放状态下斑马鱼P2X4受体的晶体结构,每个亚基形状像一只海豚。其中相邻亚基的头部,身体,左鳍和背部构成了ATP的结合口袋。研究预测,ATP结合后,头部和背鳍部区域会相互靠近。但是,目前还没有功能数据证实背鳍部在ATP结合中的作用。本论文结合点突变和电生理方法,初步探索了背鳍部氨基酸在受体正常功能实现中所起作用。 主要研究结果总结如下: (1)背鳍部214位亮氨酸影响了受体功能。214位亮氨酸单突变为丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸或者苯丙氨酸都极大的改变了受体对ATP的敏感性。而突变背鳍部216位丝氨酸,223位苏氨酸和224位天冬氨酸对受体的功能均无影响。 (2)将214为亮氨酸突变为半胱氨酸(L214C),其携带的游离巯基可以被硫醇化合物(MTS)共价修饰。预先用MTSES-或者MTSEA+孵育可以明显抑制ATP激发的电流。相反,用高浓度ATP和MTSES共同作用受体,电流没有明显抑制。 (3)P2X受体拮抗剂TNP-ATP在L214A突变体上的拮抗作用有所下降,并且用外液冲洗后,电流与野生型相比,更快恢复到原来的大小。 (4)214位亮氨酸还参与了通道的失敏。L214I突变体显著加快了通道的失敏,而L214M突变体减慢了通道失敏。 综上所述,214位亮氨酸参与了P2X4受体ATP的结合,同时也参与了激活和通道失敏过程中伴随的构象变化。本研究最终证实了背鳍部与之前报道的身体部结构域类似,对受体正常功能的发挥具有重要作用。