论文部分内容阅读
猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种猪烈性传染病。我国在国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）中将猪瘟列为五种优先防治的一类动物疫病之一。早在20世纪50年代，中国学者通过将猪瘟病毒强毒株在兔体内连续传480余代后，成功培育了安全有效的猪瘟兔化弱毒疫苗株即C株或HCLV株。该疫苗株能引起兔体定型热反应，能给免疫猪提供完全免疫保护。本研究以CSFV石门株cDNA全长感染性克隆为骨架，构建了一系列替换HCLV株基因组不同部分的嵌合感染性克隆，采用基于RNA聚合酶Ⅱ的反向遗传操作系统拯救相应嵌合病毒，用PCR、针对强弱毒荧光定量PCR、间接免疫荧光试验、抗原捕捉ELISA等方法对拯救的嵌合病毒进行验证，证明7种嵌合病毒拯救成功。病毒生长动力学及免疫荧光试验表明，以石门株基因组为骨架、5端非编码区（5-NCR）被弱毒相应序列替换的嵌合病毒vSM-HCLV5NCR与石门株在SK-6细胞上的增殖水平相似，其它嵌合病毒的生长水平与石门株相比都有不同程度的减弱。以石门株基因组为骨架、3端非编码区（3-NCR）被弱毒相应序列替换的嵌合病毒vSM-HCLV3NCR增殖能力略强于HCLV株，仅5-NCR保留石门株序列的嵌合病毒生长速度低于HCLV株，而其它嵌合病毒和HCLV株生长水平没有显著差别。为了确定HCLV株适应家兔的基因组决定区域，将拯救的嵌合病毒进行家兔接种试验，有趣的是，所拯救的嵌合病毒均没有引起家兔的体温反应，即便是嵌合病毒vHCLV-SM5NCR，其基因组与HCLV株仅在5-NCR处有9个核苷酸的差异。接种后10d，用HCLV株攻击所有接种家兔，结果显示，除了DMEM接种兔外，所有嵌合病毒接种兔能抵抗HCLV株的攻击，这表明，HCLV株的兔体定型热表型是其全基因组序列综合作用的结果，而不是部分区域单独在起作用。接种嵌合病毒后3d，能在含有HCLV株全部编码区序列的嵌合病毒vHCLV-SMNCR、vHCLV-SM3NCR和vHCLV-SM5NCR接种兔脾脏中检测到病毒增殖，且增殖水平与HCLV株没有显著差异，而从其它嵌合病毒接种兔脾中没有检测到病毒复制，这说明，HCLV株的编码区序列对其适应家兔脾脏增殖起着决定性作用，而单独的5或3半端编码区并不足以使HCLV株在家兔脾脏内增殖。究竟是什么原因使其能在兔脾脏中增殖却不引起家兔体温反应有待于进一步研究。