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目的:骨形成蛋白(bone morphogenetic protein-2,BMP2)是 FDA 批准的用于骨缺损修复的药物,在推荐剂量(1.5mg/ml)下,近年来临床报道其骨修复作用常伴随严重并发症,例如炎症、过度脂肪沉积导致新生骨结构不良或囊性骨形成等。其中新生骨结构不良及囊性成骨的发生是由于BMP2诱导的成脂基因—过氧化物酶增殖物活化受体 γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-y,PPARy)过度表达,进一步导致骨缺损区过度生成脂肪组织。骨组织的主要再生来源于骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BMSCs)分化成骨组织细胞。BMSCs具有多向分化能力,BMP2对BMSCs的分化诱导并非特异性成骨分化,而是成骨、成脂肪等多向分化。由于BMSCs数量有限,各向分化细胞系间存在竞争关系,因此,骨髓内过度生成脂肪的结果,是以牺牲骨生成为代价,导致新生骨结构功能不良。因此,如何能够既保留BMP2的促成骨能力,又减少其过度成脂引发的副作用,是本研究的根本问题。方法:从细胞内分子信号水平,通过分离培养Axin2+/-小鼠原代BMSCs,应用基因干扰技术中的短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA),以慢病毒为载体靶向将BMSCs内的PPARγ基因沉默,以抑制成脂基因PPARγ的表达,再加入BMP2作用,然后用MTT法检测BMP2诱导的BMSCs的活性和生长增殖能力,用细胞划痕法和Transwell小室法分别检测细胞在二维空间和三维空间内的迁移能力,用Annexin V染色流式细胞仪检测细胞凋亡数量变化,用成骨诱导培养体系诱导BMSCs,观察细胞成骨分化能力,用荧光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测成骨相关基因骨 钙素(Osteocalcin,OCN)、RUNX2(Runt-related transcription factor 2),碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)及成脂相关基因PPARγ的表达,BMP各型受体(1A,1B及2型受体)的表达、以及Wnt信号通路中主要原件β-catenin和Smad2/3的表达。另一方面,制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)人工骨支架并对其进行性能测定;然后利用小鼠股骨临界骨缺损模型,以PLGA支架负载BMP2蛋白修复,观察PPARγ shRNA(shPPARy)对骨修复再生的影响。术后每周检查X光,动态检测骨愈合进程。术后8周处死动物,Micro-CT扫描股骨,得到股骨3D重建影像及量化分析指标,包括骨体积分数(bone volume/total volume,BV/TV)、骨密度(bone mineral density,BMD)、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N),并对骨组织进行病理学检测,观察新生骨微观结构及细胞内成骨、成脂相关蛋白的表达变化。结果:在体外试验中,RT-PCR检测PPARγ mRNA的表达结果显示,与空白对照组比较,72h瞬转shPPARγ组抑制率为60%,稳转shPPARγ组抑制率为90%,即PPARγ shRNA能够起到基因沉默作用,可应用于进一步的研究。72h时BMP2组BMSCs的增殖数量较PBS对照组升高了 46%(P<0.05),BMP2+shPPARγ组BMSCs 的增殖数量较 BMP2+shContorl 组降低了 50%(P<0.01)。21h 时 BMP2 组BMSCs的迁移能力较PBS对照组升高了 209%(P<0.01),BMP2+shPPARγ组BMSCs 的迁移能力较 BMP2+shContorl 组降低了 57%(P<0.01)。BMP2+shPPARγ组细胞凋亡(18.4%)显著高于PBS组(1.6%)和BMP2组(3.2%)(P<0.005)。成骨分化诱导21d后,BMP2组BMSCs成骨分化形成的钙化结节较PBS对照组增加了 532%(P<0.01),BMP2+shPPARγ组BMSCs成骨分化形成的钙化结节较BMP2+shContorl组降低了 34%(P<0.05)。与PBS对照组相比较,BMP2组的成骨相关基因mRNA表达均显著升高(P<0.01)。与BMP2+shContorl组相比较,BMP2+shPPARγ组成骨相关基因mRNA表达均显著降低(P<0.01)。3d时BMP2组 BMPR2 mRNA 表达较 PBS 对照组升高了 85%(P<0.01),BMP2+shPPARγ 组BMPR2 mRNA 表达较 BMP2+shContorl 组降低了 44%(P<0.01)。3d 时 BMP2 组BMPR2表达阳性的BMSCs计数较PBS对照组升高了 1.89倍(P<0.005),BMP2+shPPARγ 组 BMPR2 表达阳性的 BMSCs 计数较 BMP2+shContorl 组降低了23%(P<0.05)。3d 时 BMP2 组 β-catenin mRNA 表达较 PBS 对照组升高了 36%(P<0.05),BMP2+shPPARγ 组 β-catenin mRNA 表达较 BMP2+shContorl 组降低了24%(P<0.05)。BMP2 组 Smad2/3 mRNA 表达较 PBS 对照组升高了 32%(P<0.05),BMP2+shPPARγ 组 Smad2/3 mRNA 表达较 BMP2+shContorl 组降低了 28%(P<0.05)。制备的PLGA多孔支架具有良好的微孔与大孔连通性。微孔直径在10～30μm的,整个孔壁呈蜂窝状结构,有利于营养物质和细胞代谢物的的传输。大孔孔径为200～300μm之间,孔隙率在90±5%,无毒性。在动物实验中,所有实验动物均以PLGA支架修复,其中对照组支架上负载了 PBS,实验组中的阳性对照组的支架上负载了 BMP2蛋白,术后8周时,实验阳性对照BMP2组在骨缺损区形成骨连接,但同时也形成了超越缺损区范围生长的、内含多个蜂窝状小囊性结构的新生骨,新生的骨组织微观结构不良,伴有大量脂肪组织浸润,骨小梁纤细,骨皮质薄弱,PLGA支架已基本完全吸收。在实验组BMP2+PPARγ基因沉默后,小鼠临界性骨缺损区的骨连接及骨囊性生长均显著减少,BMP2+shPPARγ组新生骨结构较BMP2组及BMP2+shContorl组均改善,脂肪浸润显著减少,骨纤维增粗,PLGA支架仍有残留。在Micro-CT感兴趣区域内,BMP2组的BV/TV和Tb.N较PBS对照组分别增加了 106%和125%(P<0.01),BMP2+shPPARy 组的 BV/TV 和 Tb.N 较 PBS 组分别增加了 37%和 54%(P<0.01),BMP2+shPPARy 组的 BV/TV 和 Tb.N 较 BMP2+shContorl 组分别降低了 48%和 52%(P<0.01)。骨组织切片的HE染色显示新生骨结构特点与Micro-CT结果相符。免疫组化染色显示,与BMP2组相比,BMP2+shPPARγ组的成骨相关蛋白如OCN、RUNX2等表达下降(P<0.01),成脂相关蛋白PPARγ表达也显著下降(P<0.01)。BMPR2型受体表达显著下调(P<0.05),β-catenin表达变化无统计学差异。结论:慢病毒转染小鼠BMSCs转染效率高,转染的BMSCs传代后PPARγ沉默效应稳定。在BMP2诱导的骨缺损修复过程中,PPARγ不但是成脂诱导分化的最重要因子,而且也是成骨诱导分化的重要组成之一,参与了 Wnt信号通路和BMP2信号通路的双向调节。抑制PPARy,导致BMPR2和BMPR1B表达降低,使BMP2信号通路难以活化,分子信号传导中断,不利于骨修复的最终结果。理论上不可通过抑制PPARγ来抑制BMP2诱导的骨修复中的成脂副反应。