目的:侵袭性真菌病（Invasive fungal disease,IFD）是严重危害人类健康甚至危及生命的感染性疾病。两性霉素B（AmB）是治疗IFD的经典药物和最后一道防线,目前AmB多为去氧胆酸盐（AmB-DOC）制剂,其严重的不良反应尤其是剂量限制性肾毒性,限制了AmB的应用。新型注射用两性霉素B脂质体（Liposomal amphotericin B,Lipo-AmB,Gilead生产,AmBisome?）为单室双层脂质体,与AmB-DOC相比,Lipo-AmB（AmBisome?）可显著降低肾毒性及输注相关不良反应,国外已上市约三十年,国内尚处于研发阶段。两性霉素B普通注射制剂AmB-DOC给药后一周尿液、粪便和血液中两性霉素B约可回收给药剂量的90%。而给予Lipo-AmB后一周内尿液和粪便排泄率各仅约5%,尿液、粪便和血液循环系统的总两性霉素B只回收给药剂量的25%左右,仍有高达75%给药剂量的两性霉素B分布无法解释,只是推测其保留在深层组织中。说明改良为脂质体制剂后,AmB体内PK和组织分布行为均发生了显著的变化。两性霉素B具有较强的肾毒性,其肾毒性与肾脏药物浓度密切相关;两性霉素B为浓度依赖型杀菌药,杀菌效果与其靶组织药物浓度直接相关。因此,靶组织浓度的预测对临床疗效和安全性至关重要,对制定安全有效的个体化治疗方案具有重要的指导意义。但是,通常我们只能获得一定给药剂量后的人体血药浓度,因伦理等原因,药物在人体各组织的暴露水平几乎不可获得。而基于生理的药动学（Physiologically based pharmacokinetic,PBPK）模型以生理解剖学为基础,将每一个主要生理器官看成一个隔室,经血液循环相互连接,并结合药物特异性的动力学参数,建立微分方程组,计算出各个隔室中药物的经时浓度。基于此,本课题进行了Lipo-AmB临床前和临床药代动力学研究,建立注射用两性霉素B脂质体的生理药代动力学（PBPK）模型,预测和描述人体靶组织中脂质体包裹、非包裹和总AmB的浓度及经时过程,初步探索患者剂量-暴露-肾毒性关系,探究Lipo-AmB给药后靶组织暴露水平的影响因素,为中国人群治疗方案的制定优化和已知风险的控制提供借鉴。研究方法:1.建立测定人血浆脂质体包裹、非包裹和总两性霉素B的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）方法:Lipo-AmB进入血液循环后,以脂质体包裹形态、非包裹形态存在,其中脂质体包裹形态为主;本文分别建立测定人血浆基质中脂质体包裹、非包裹和总两性霉素B的三个LC-MS/MS测定方法,并根据相关指导原则,对所建立的LC-MS/MS方法进行系统验证。2.Lipo-AmB在中国人群中的药代动力学研究。健康人单次给药药代动力学研究:进行12例开放、单剂量、两周期交叉健康人体药代动力学研究,Lipo-AmB给药剂量为2 mg/kg,获得Lipo-AmB给药后血浆中脂质体包裹、非包裹和总两性霉素B在中国健康人群的PK特征和耐受性;患者多次给药药代动力学研究:共入组36例中性粒细胞缺乏伴发热患者,每位受试者接受2周期用药,每周期给药5天,每天给药一次,给药剂量为3 mg/kg,输注时间2 h,分别获得脂质体非包裹、包裹和总两性霉素B的PK参数;评价Lipo-AmB在该疾病患者中的耐受性和安全性。3.生理药代动力学（PBPK）模型建立与应用:进行注射用两性霉素B脂质体（Lipo-AmB）和两性霉素B去氧胆酸盐制剂（AmB-DOC）在SD大鼠体内的组织分布研究,探究两性霉素B不同制剂在大鼠体内处置过程。本研究采用逐步法建立PBPK模型,采用临床前数据,建立大鼠水平PBPK模型,再比放至小鼠水平进行验证,最终外推至人体水平。首先收集文献报道的大鼠生理参数,AmB药物依赖性参数如血浆蛋白结合率、清除率等,结合大鼠PK采血和组织分布数据,构建大鼠AmB-DOC的PBPK模型,依据物料守恒原理建立模型方程,模型代码的编写、参数的拟合以及模型的运行模拟在Berkeley Madonna?（version 8.3.23;University of California,Berkeley,CA,USA）上进行。对模型参数进行种属间比放,在小鼠水平上验证后最终将AmB-DOC的PBPK模型外推至人体水平。在AmB-DOC的PBPK模型基础上,我们结合大鼠Lipo-AmB给药后的PK采血和组织分布数据,构建大鼠Lipo-AmB的PBPK模型,在小鼠水平验证后,外推至人体水平,采用中国人群药代动力学研究中的脂质体包裹两性霉素B和非包裹两性霉素B血药浓度和文献报道的人体组织浓度数据进行验证,对Lipo-AmB给药后脂质体包裹两性霉素B和非包裹两性霉素B在人体血液及各主要组织的暴露水平进行预测和描述,探究影响两性霉素B暴露水平的因素。结果:1.建立测定人血浆脂质体包裹、非包裹和总两性霉素B的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）方法:加入血浆样品的冷冻稳定保护剂-35%葡萄糖溶液（LPStab07）,脂质体包裹、非包裹两性霉素B在-80℃短期、长期和冻融条件下均稳定。样本处理过程中脂质体包裹两性霉素B稳定,未转化为非包裹两性霉素B,所建立的固相萃取（SPE）法可将脂质体包裹和非包裹分离完全;分别建立测定人血浆中脂质体包裹、非包裹和总两性霉素B的测定方法,在所验证的色谱及质谱条件下,待测物和内标的分离良好,内源性杂质不干扰测定。脂质体包裹、非包裹和总两性霉素B分别在浓度为100～50000 ng/ml、10.0～3000 ng/ml和100～50000 ng/ml范围内线性关系良好,定量下限分别为100、10.0和100 ng/ml。三种方法精密度、准确度、回收率、基质效应、残留考察、稀释可靠性和稳定性考察均符合方法学的要求。2.Lipo-AmB在中国人群中的药代动力学研究。健康人单次给药药代动力学研究:注射用两性霉素B脂质体给药后,血浆中两性霉素B主要以脂质体形式存在,给药后72 h血浆中包裹型AmB/总AmB大于90%,给药后一周包裹型AmB/总两性霉素B约为70%,之后迅速下降,给药后216 h包裹型AmB已低于定量下限（100ng/ml）。非包裹型两性霉素B的终末半衰期较长408.63±117.29 h,达峰浓度约为900 ng/ml,仅为总两性霉素B Cmax的4%;患者多次给药药代动力学研究:本研究中,持续中性粒细胞缺乏伴发热患者静脉输注Lipo-AmB 3 mg·kg-1/d,连续给药10天,总两性霉素B的Css,max为26.9±14.5μg/ml,AUC0-τ为249.6±195.0 h·μg/ml。患者连续输注Lipo-AmB 10天后,血浆中包裹两性霉素B和非包裹两性霉素B的存在比率分别为89.74%±11.11%和10.94%±6.04%。本研究与两性霉素B相关的肾毒性和肝毒性不良反应:肾损害共5例,发生率为13.9%,严重程度为轻中度;肝损害共11例,发生率为30.6%,严重程度多为中度。综合各人群肝毒性和肾毒性结果,中国人群的发生率均低于已有报道人群,各人群的肝肾毒性不良反应类型相似。3.生理药代动力学（PBPK）模型建立与应用。临床前动物实验结果表明:Lipo-AmB改变了普通两性霉素B制剂（AmB-DOC）大鼠体内的药代动力学特征,Lipo-AmB主要分布于脾脏和肝脏,上述器官中占比超过总暴露的80%,其在肾脏中的分布比例（肾脏暴露量/总暴露）小于1%;而AmB-DOC则较多分布于肾脏,暴露量占比约15%,远高于Lipo-AmB的肾脏分布比例。根据PBPK模型可以预测出Lipo-AmB给药剂量为6 mg·kg-1/d肾脏非包裹两性霉素B暴露量与AmB-DOC给药剂量为0.7 mg·kg-1/d肾脏两性霉素B暴露量相当,因此推测Lipo-AmB给药剂量为6 mg·kg-1/d与AmB-DOC给药剂量为0.7 mg·kg-1/d肾脏安全性相近,由PBPK模型推导出的结果与临床试验观测效应相符。虽然已有的剂量毒性研究,儿童10mg/kg和成人15 mg/kg均未发现剂量限制性毒性,但根据模型预测结果,基于安全性考虑,建议临床应用剂量不超过6 mg·kg-1/d。对给予Lipo-AmB患者的PBPK模型的参数进行敏感性分析发现,血浆中非包裹两性霉素B和肾脏中非包裹两性霉素B对脂质体快速释放比例（FR）和脂质体释放速率（rel）相对比较敏感,提示脂质体的包封率、组成成分和结构等对药物的有效性和安全性有一定的影响。结论:1.建立的测定人血浆中脂质体包裹、非包裹和总两性霉素B的LC-MS/MS法,可用于Lipo-AmB人体内浓度测定及临床研究。2.在中国健康人单次给药后72 h内和患者多次给药达稳态后24 h内,血浆中约90%及以上的两性霉素B均以脂质体形式存在。中国健康人Lipo-AmB（AmBisome?）2 mg/kg单次给药后的总两性霉素B Cmax（24.29±5.44μg/ml）,高于患者3 mg/kg连续给药5次后的Cmax（17.55±6.94μg/ml）,与患者连续给药10次的Cmax（26.89±14.48μg/ml）基本一致。患者稳态药代动力学研究中,与研究药物相关的TEAE发生率为97.2%（35/36）,严重程度多数为中度,转归多数为恢复/痊愈,说明该给药剂量下患者可以耐受。3.通过临床前和临床药代动力学研究,建立了Lipo-AmB的PBPK模型,成功地预测和描述Lipo-AmB给药后人体靶组织的浓度和经时过程,初步探索了剂量-暴露量与肾毒性的相关性及Lipo-AmB给药后靶组织暴露水平的影响因素。