论文部分内容阅读
目的为深入地研究CLIC1基因在哺乳动物细胞中的生物学功能,我们用酵母双杂交系统筛选出CLIC1结合蛋白β1,4-半乳糖转移酶Ⅱ(β4GalTⅡ),接着我们构建了相关的β4GalT-Ⅱ表达载体(CLIC1相关载体已经构建),随后我们试图用免疫荧光显微技术、GST-pulldown技术以及免疫共沉淀技术证明CLIC1与β4GalTⅡ是否存在相互作用。方法利用PCR方法扩增野生型β4Gal TⅡ片段,并将其定向构建到真核酵母载体pGADT7及pGBKT7,小规模制备酵母感受态细胞,将转化含外源融合基因β4GalTⅡ及CLIC1的酵母重组表达质粒分别共转化进酵母AH109中,转化的酵母细胞铺于SD/-Leu/-Trp/-His/3AT-α-gal盘上进行筛选,通过酵母双杂交技术检测β4GalTⅡ蛋白是否是CLIC1蛋白的结合蛋白。接着分别设计带FLAG标签和GFP标签的β4GalTⅡ基因的特异性引物,以含人类β4GalTⅡ基因全长的cDNA文库片段为模板,定向构建到pcDNA3.1(+)及pCDGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-β4GalTⅡ-FLAG和pCDGFP-β4GalTⅡ。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体后,利用脂质体法分别单独转染不同标签的β4GalTⅡ及CLIC1质粒进COS7细胞,免疫荧光显微镜观察其在细胞内的定位情况。之后将pcDNA3.1-β4GalTⅡ-FLAG和pCDGFP-CLIC1,pCDGFP-β4GalTⅡ和pcDNA3.1-CLIC1–FLAG互换标签共转进COS7细胞,研究各组蛋白在哺乳动物细胞内的共定位情况。接着将GST和GST-CLIC1转化进BL21感受态,制备相关融合蛋白,分别将两种不同标签的β4GalTⅡ质粒瞬时转染进HEK 293T细胞,通过GST Pull-down技术检测CLIC1蛋白与β4GalTⅡ蛋白在体外是否存在相互作用。最后,将pcDNA3.1-β4GalTⅡ-FLAG和pCDGFP-CLIC1,pCDGFP-β4GalTⅡ和pcDNA3.1-CLIC1–FLAG互换标签瞬时转染进HEK 293T细胞,利用免疫共沉淀技术检测CLIC1蛋白与β4GalTⅡ蛋白在哺乳动物体内是否存在相互作用。结果酶切及测序结果证实pcDNA3.1-β4GalTⅡ-FLAG、pCDGFP-β4GalTⅡ、pGADT7-β4GalTⅡ及pGBKT7-β4GalTⅡ重组表达质粒构建成功。酵母双杂交实验表明:真核酵母细胞内即时共表达的β4GalTⅡ蛋白和CLIC1蛋白具有部分α-半乳糖苷酶活性,提示二者可能存在一定的相互作用。免疫荧光实验观察发现:pcDNA3.1-β4GalTⅡ-FLAG及pCDGFP-β4GalTⅡ蛋白在二者在COS7细胞中均主要定位在细胞核周围,并有明显的块状染色,胞核中未见明显分布。CLIC1蛋白在细胞中主要分布于细胞核和细胞核膜,也有部分分布于细胞质中。两种蛋白的定位均未因标签改变而发生明显变化。共定位实验显示CLIC1蛋白与β4GalTⅡ蛋白没有明显的共定位。后续的GST pull-down实验证实CLIC1蛋白在体外条件下不能下拉β4GalTⅡ蛋白,免疫共沉淀实验也进一步表明,在HEK 293T细胞中,CLIC1蛋白不能把β4GalTⅡ蛋白共沉淀下来。结论酵母双杂交实验所体现出的CLIC1蛋白和β4GalTⅡ蛋白之间可能的相互作用是假阳性状态。间接免疫荧光实验、GST pull-down实验及免疫共沉淀实验共同验证了CLIC1蛋白和β4Gal TⅡ蛋白在体内外均不存在明显的相互作用。目的针对人源孕酮诱导的蜕膜蛋白(DEPP)外显子拼接功能区(CDS)基因,运用重叠延伸PCR法构建DEPP两种不同类型的突变体(点突变,中间缺失突变),并将其分别转染到COS7细胞中观察蛋白在细胞内的定位变化。方法设计带FLAG-tag的DEPP基因的S34A点突变和N端31~35位氨基酸(PPPSP)缺失的特异性引物,以重组质粒GFP-DEPP为模板,通过重叠延伸PCR法,得到34位S→A点突变体和△PPPSP缺失的DEPP基因,定向构建到pc DNA3.1真核表达载体上,构建重组表达质粒。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体后,利用脂质体法分别转染COS-7细胞,激光共聚焦扫描显微镜观察其在细胞内定位。结果成功构建DEPP关键位点突变体pc DNA3.1-FLAG-DEPP(S34A)和中间缺失突变体pc DNA3.1-FLAG-DEPP(△PPPSP)。定位试验表明:转染后激光共聚焦扫描显微镜观察,DEPP(S34A)和DEPP(△PPPSP)二者在COS7细胞中主要定位在核周,并有明显的点状染色,胞浆中也有广泛的分布。结论获得了DEPP基因S34A位点突变体和△PPPSP中间缺失突变体并能在细胞中表达,为进一步研究DEPP的功能及其与其他蛋白的相互作用位点奠定了一定基础。