蒙古白丽蘑的化学成分、药理作用及其相关机制的研究

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本文对采自于内蒙古呼伦贝尔草原的蒙古白丽蘑进行化学成分分析,包括营养成分、重金属含量测定,并且对蒙古白丽蘑不同成分(总多糖、总蛋白、小分子类化合物、总甾醇类化合物及两种甾醇类单体化合物)进行体内、体外肿瘤抑制实验,探讨其作用机理,对效果最好的组分进行高通量血液非靶向代谢组学研究及肠道菌群的调节作用研究,并探讨蒙古白丽蘑的总多糖、甾醇类化合物及水提液进行降血糖实验研究。通过凯氏定氮法、氨基酸自动分析法、索氏抽提法、电感耦合等离子体原子发射光谱法及灼烧法等方法对蒙古白丽蘑营养成分进行分析,如蛋白质、氨基酸、多糖、灰分及氨基酸组成。结果表明,蒙古白丽蘑总蛋白质含量为总蛋白含量为43.56%,总多糖含量为35.58%,总灰分含量为9.2%,粗纤维含量为1.09%;氨基酸含量与金针菇、杏鲍菇及滑子蘑等9种常见食用菌相对比,人体所需必需氨基酸含量在蒙古白丽蘑中的占比明显高于其他几种;蒙古白丽蘑重金属含量低,符合国家+++标准,为一级食用产品,食用安全。应用GC-MS及LS-MS等方法,对蒙古白丽蘑子实体的化学成分进行系统分析。GC-MS分析结果表明,共检测到31种匹配度高于85%化学成分,所有检测出的化合物均以极性较小的易挥发性脂肪族化合物为主;经LS-MS分析,得到化合物共50种,其中检测出酚类化合物9种、脂肪酸类化合物12种、核苷酸类化合物3种、醌类化合物8种、糖类成分6种及甾体类成分4种几个化合物类群,另外还有其他类化合物8种。应用正向硅胶、Sephadex LH-20柱色谱方法对蒙古白丽蘑甾醇类化合物进行分离提取,其几种甾体类化合物为麦角甾醇过氧化物、麦角甾醇、(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇、麦角甾-4,6,8(14),22(23)-四烯-3-酮等9种化合物。本研究对蒙古白丽蘑化学物质基础特点有了整体性了解,为其活性研究提供基础。由于蒙古白丽蘑的不合理的人为采集及环境条件的恶化,使蒙古白丽蘑栖息地收到破坏,该物种濒临灭绝。应用深层发酵方式量产其发酵菌丝体,尝试在应用上替代蒙古白丽蘑子实体为有助于保护该资源的有效途径之一。在前期基础上,对其高密度发酵罐发酵培养条件进行了优化实验,结果表明:培养基配方为黄豆粉16.55g/L,玉米浆粉33g/L,蔗糖在初始条件下为33g/L,随着发酵时间的推移,逐渐增至9%;发酵条件为10L发酵罐条件优化下,在25℃条件下,初始p H调整为为6.5,发酵罐机械转子转速150 rpm,初始接种量12.5%,为发酵罐最佳培养条件,以此条件在50L及100L发酵罐进行放大培养,最终结果:50L发酵罐在216h时,生物量达到最大,17.84g/L;100L发酵罐在192h时生物量达到19.64g/L。随着发酵罐体的放大,可以明显的缩减发酵周期,为蒙古白丽蘑液体发酵工业化生产提供依据。其发酵菌丝体与子实体化学成分进行对比,结果表明,发酵菌丝体分析得到的化合物共31个,分别为酚类成分、糖类成分、醌类成分、核苷酸、脂肪酸、甾醇类及其他成分,其中大部分化合物与子实体共有。蒙古白丽蘑不同组分抗肿瘤研究方面,通过脏器指数及抑瘤率计算、ELISA酶联免疫法、H&E病理切片、TUNEL、免疫组化荧光分析法及蛋白质免疫印迹法对蒙古白丽蘑总蛋白(TPLM)、总多糖(LMP)、甲酸(ELM)提取的小分子类化合物、总甾醇类(SLM)化合物及麦角甾-4,6,8(14),22(23)-四烯-3-酮、(22E,24R)-麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇进行体内抗肿瘤实验,同时对两种单体化合物进行体外抗肿瘤实验。实验结果表明,以上蒙古白丽蘑组分对H22荷瘤小鼠肿瘤抑制情况均有明显的抑制表现活性,其中以蒙古白丽蘑总甾醇化合物(SLM)及总多糖(LMP)活性最佳。并对SLM进行高通量非靶向代谢组学研究及肠道菌群的调节作用研究。结果表明,通过SLM治疗后的H22荷瘤小鼠,与模型组相比,经肿瘤微环境影响机体代谢发生紊乱所产生强烈扰动的化合物在色氨酸代谢途径、5-羟色胺能突触途径、蛋白质消化吸收途径、亚油酸代谢途径、氨基酸的生物合成途径与花生四烯酸代谢途径等几个代谢通路中发生明显的回调状态,具有肿瘤抑制作用的表现。肠道微生物变化作用,SLM给药组中,普雷沃菌属及相关菌属为优势菌属(Prevotella),隶属该属多种细菌被证实具有促进脂质代谢、治疗代谢综合征、癌症等多种疾病。除此之外,考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)与拟杆菌属(Bacteroides)在SLM组中也大量富集,对维持人体健康具有多种重要作用,为身体提供必需的营养。蒙古白丽蘑降血糖作用研究,对蒙古白丽蘑总多糖(LMP)、水提液(WLM)及肿瘤抑制实验最好组总甾醇组(SLM)应用测量空腹血糖、ELISA法、糖耐量检测法、Western Blot法进行降血糖实验研究。实验结果表明,蒙古白丽蘑总多糖(LMP)及水提液(WLM)均具有良好的降血糖作用,治疗4周可以显着改善葡萄糖和脂质代谢以及胰岛素抵抗作用。而SLM组降血糖作用并不明显。这些结果表明蒙古白丽蘑具有降血糖作用的活性物质基础是总多糖(LMP)与水提液(WLM),可以用作预防和治疗糖尿病的有效成分研发利用。
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