微孢子虫是一种专营细胞内寄生的单细胞生物,能感染从原生动物到哺乳动物,包括昆虫,鱼类和人类在内的几乎所有的动物。家蚕、柞蚕微孢子虫是引起家蚕和柞蚕微粒子病的病原,微粒子病对养蚕业来说是一种毁灭性的病害。我国每年因为微粒子病烧掉的蚕种价值上亿元,特别是近两年微粒子病在中国蚕业生产上又有回头的趋势。因此,对微孢子虫的研究既具有理论意义,也具有经济价值。本研究以家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫为实验材料,克隆测序了柞蚕微孢子虫的核糖体基因,为柞蚕微孢子虫的分类和系统进化分析提供分子生物学的依据,也从分子水平上分析了家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的进化关系。结合二维电泳和质谱技术分离、鉴定了家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的总蛋白,在整体水平上分析了微孢子虫的蛋白质组成。用比较蛋白质组学的方法比较了家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫接种五龄家蚕后不同时间段家蚕中肠的蛋白质变化,分析了家蚕中肠对微孢子虫的应答模式,从蛋白质组的水平上筛选与感染相关的特异性蛋白标志物和抗性功能相关的蛋白。一、柞蚕微孢子虫的核糖体基因用特异引物进行PCR扩增,克隆和测序了柞蚕微孢子虫的核糖体基因,得到柞蚕微孢子虫LSU rRNA基因的部分序列,SSU rRNA,5S rRNA和转录间隔区(ITS1和ITS2)的全序列(Genbank登录号为DQ073396)。柞蚕微孢子虫的核糖体基因排列顺序为LSU—ITS—SSU—ITS—5S,和家蚕微孢子虫的排列顺序相同,是一种即不同于真核生物,也不同于原核生物的排列顺序。用SSU rRNA和ITS序列进行同源比对和进化分析,柞蚕微孢子虫属于Nosema属,是和家蚕微孢子虫进化关系很近的一个种。本研究为柞蚕微孢子虫的分类提供了分子生物学的证据,将微孢子SSU rRNA基因和ITS结合起来分析微孢子虫的亲缘关系是一个很好的尝试。二、家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫的蛋白质组学研究用蛋白质组学的方法研究了微孢子虫的蛋白质组。纯化的微孢子经液氮研磨和超声波破碎,用蛋白抽提液抽提微孢子总蛋白,然后二维电泳,质谱鉴定。家蚕微孢子虫鉴定到16个蛋白,其中有4种酶,2种转录调控因子,2种膜通道蛋白,1种细胞骨架结构蛋白,1种信号分子相关的蛋白,1种核糖体蛋白和5种功能未知蛋白。柞蚕微孢子虫鉴定到9个蛋白,其中有3种酶,3种转录调控因子,1种外膜糖蛋白,1种钙离子相关的膜通道蛋白和1种热激蛋白。结合生物信息学和文献检索的方法,初步分析了这些蛋白的功能。在家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫鉴定的蛋白质中发现,酶、转录调控因子和膜蛋白占了较大的比例,说明酶、转录调控因子和膜蛋白确实是微孢子虫孢子时期大量表达和存在的蛋白质,这也与孢子的结构和生理吻合。三、家蚕微孢子虫,柞蚕微孢子虫和清水接种家蚕后家蚕中肠的比较蛋白质组学研究取接种家蚕微孢子虫,柞蚕微孢子虫和清水对照处理后的24h,48h,72h家蚕(品种:C108)中肠总蛋白,进行二维电泳和质谱鉴定。用比较蛋白质组的方法对接种不同微孢子虫后不同时间段的中肠蛋白质的变化和家蚕中肠对微孢子的应答机制进行了研究。总的来说,许多酶类表现出表达量的差异,在取材的三个时间段中,大部分参与碳水化合物代谢的酶在接种家蚕微孢子虫的家蚕中肠中呈现下调的趋势,如烯醇酶和羟基丙酮酸异构酶;而参与蛋白质和氨基酸降解的酶类却呈上调的趋势,如蛋白酶和延胡索酰乙酰水解酶。在接种家蚕微孢子虫的家蚕中肠的H+通道V-ATPase比接种柞蚕微孢子虫和清水的有减少的趋势。有趣的是参与免疫和应答反应的一些蛋白,接种家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫24h后的家蚕中肠中的表达量都比对照高,在72h后,接种家蚕微孢子虫的表达量比接种柞蚕微孢子虫和对照的低。这个结果和PD-QUEST软件分析的二维电泳图谱的结果一致。肌动蛋白解聚合因子4(actin-depolymerizing factor 4),硫氧化/还原蛋白过氧化物酶(thiol peroxiredoxin)和抗胰糜蛋白酶前体(antichymotrypsin precursor)是差异蛋白中最值得研究和重视的蛋白。肌动蛋白解聚合因子是一种在真核生物中广泛存在的肌动蛋白结合蛋白,在调控细胞内肌动蛋白纤丝的解聚合和再聚合中起着关键作用。在接种微孢子实验中,肌动蛋白解聚合因子4表现出明显的差别,在接种了家蚕微孢子虫24h和72h时的家蚕中肠的二维电泳银染图中没有肌动蛋白解聚合因子4,而接种柞蚕微孢子虫和对照中却有该蛋白明显的染色。说明感染了家蚕微孢子虫的中肠细胞的肌动蛋白纤丝的解聚合和再聚合平衡被打破,中肠细胞的细胞骨架遭到破坏。肌动蛋白纤丝的解聚合和再聚合平衡被打破是家蚕微孢子虫在家蚕中肠细胞中生长发育的前提还是微孢子虫感染后的病理反应还需进一步的研究。肌动蛋白解聚合因子4有可能成为治疗和鉴定家蚕感染微孢子虫的目标蛋白。硫氧化/还原蛋白过氧化物酶是一种抗氧化酶系,在生物体对活性氧族的防御系统中和在宿主与寄生虫之间的相互影响中起着主要作用。硫氧化/还原蛋白过氧化物酶在取材的24h,48h和72h都被鉴定出表达量上的差异。接种家蚕微孢子虫和柞蚕微孢子虫24h时后,该蛋白在家蚕中肠中表达量都比对照高,48h时后,接种家蚕微孢子虫比接种柞蚕微孢子虫的表达量高,72h时后接种家蚕微孢子虫比接种柞蚕微孢子虫以及对照表达量低。说明硫氧化/还原蛋白过氧化物酶参与了家蚕中肠对微孢子虫的免疫应答。抗胰糜蛋白酶前体是抗胰糜蛋白酶因子的前体形式,没有活性,经加工后才能形成具有活性的抗胰糜蛋白酶因子。抗胰糜蛋白酶因子(antichymotrypsin)属于抑丝酶家族(serpins),参与蛋白质的加工、细胞凋亡、细胞外基质重构、以及保护细胞免受损伤等。人类细胞质中的抗胰糜蛋白酶因子的升高是烧死,外伤和一些癌症急性期的标志物。抗胰糜蛋白酶前体在接种家蚕微孢子虫72h后,家蚕中肠中的表达量远远高于在接种柞蚕微孢子虫以及对照的表达量,说明该时期的家蚕微孢子虫在中肠细胞中的快速发育。因此抗胰糜蛋白酶表达的增高有希望成为家蚕感染微孢子虫的标志。