家蚕抗菌肽CM4在E.coli中的融合表达及其抗炎症机制的研究

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抗菌肽是一种阳离子小分子多肽,在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。近年来传统抗生素耐药菌株种类不断增多,全球抗生素的滥用加速了这一过程,抗菌肽的开发将为解决这一棘手难题提供更多的途径。抗菌肽所具备的药用价值使其被开发成为新一类抗感染药物成为可能。 昆虫抗菌肽是最早发现的,也是比较重要的一类抗菌肽。抗菌肽CM4是由张双全等人从中国家蚕中诱导获得的线性两亲的、α-螺旋肽,已证明CM4是Cecropin家族中的一个成员。抗菌肽CM4具有较广泛的抗菌、抗病毒和杀伤某些肿瘤细胞的能力。 为了获得大量的抗菌肽CM4以满足其抗菌机理的研究及新药的开发,我们参照天然抗菌肽CM4氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子,采用rPCR法获得CM4基因后重组到表达载体pET32a上,在融合表达的方式将人工合成的抗菌肽CM4基因克隆到pET32a中,在E.coli中融合表达。表达产物以可溶性存在,经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析获得融合蛋白,再经甲酸切割、亲和层析和反相高效液相层析,得到纯化的具有抗菌活性的重组抗菌肽。 通过抗菌肽首先和革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖相互作用从而破坏细菌外膜这个作用机理,首次探讨了抗菌肽CM4具有中和内毒素的作用。在体外我们利用鲎实验(LAL assay)探讨抗菌肽CM4中和LPS的能力。在细胞水平上利用流失细胞仪技术分析抗菌肽CM4阻断LPS结合到巨噬细胞的能力,并在mRNA水平和蛋白水平证实了抗菌肽CM4对LPS引发的炎症因子上调具有抑制作用。
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