【摘 要】
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背景自然界中木聚糖是一种多聚五碳糖,结构非常复杂,大多数未被利用,需要经木聚糖酶降解成低聚木糖后才能被有效利用。木聚糖酶主要来源于微生物,因此构建产木聚糖酶的微生物工程菌可以丰富木聚糖酶来源,使其在工业、农业、食品以及饲料加工等多种领域的应用更加广泛。目的1.本研究从黑曲霉（Aspergillus niger）和麦氏交替单胞菌（Alteromonas macleodii）中筛选获得木聚糖酶新酶种,
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背景自然界中木聚糖是一种多聚五碳糖,结构非常复杂,大多数未被利用,需要经木聚糖酶降解成低聚木糖后才能被有效利用。木聚糖酶主要来源于微生物,因此构建产木聚糖酶的微生物工程菌可以丰富木聚糖酶来源,使其在工业、农业、食品以及饲料加工等多种领域的应用更加广泛。目的1.本研究从黑曲霉（Aspergillus niger）和麦氏交替单胞菌（Alteromonas macleodii）中筛选获得木聚糖酶新酶种,对现阶段木聚糖酶种类进行拓展。2.构建产木聚糖酶的重组工程菌,拓宽木聚糖酶研究的途径。3.优化木聚糖酶重组工程菌发酵条件,测定重组木聚糖酶的酶学性质,并为木聚糖酶的进一步分子改造奠定基础。方法1.将从黑曲霉中获得的木聚糖酶基因,通过电击转化进枯草芽孢杆菌WB600,获得产木聚糖酶的重组工程菌并对工程菌进行实验室水平的发酵优化及酶学性质测定。2.从海洋微生物中筛选出产生木聚糖酶的麦氏交替单胞菌并进行全基因组测序,确定其木聚糖酶基因。3.通过生物信息学对木聚糖酶基因进行分析,核苷酸序列经过密码子优化后合成基因序列。4.将重组木聚糖酶基因转入大肠杆菌BL21（DE3）以及毕赤酵母GS115中,获得目的基因的高拷贝转化子。5.对木聚糖酶工程菌进行发酵工艺优化,测定重组酶酶学特性。结果1.从黑曲霉基因组中获得木聚糖酶基因,成功构建3种木聚糖酶枯草芽孢杆菌WB600重组工程菌。重组菌WB600/p WB980/xyn ZF-2在接种量1.0%、种龄14 h、装液量50 m L、温度34℃条件下培养,酶活力为0.168 U/m L;WB600/p WB980/xyn ZF-318在接种量1.5%、种龄14 h、装液量30 m L、温度37℃条件下培养,酶活力为0.359 U/m L;WB600/p WB980/xyn ZL在接种量1.5%、种龄12 h、装液量30 m L、温度39℃条件下培养,酶活力为0.179 U/m L。2.通过对麦氏交替单胞菌全基因组测序结果分析,获得3段木聚糖酶基因,并提交至Genbank网站,登录号分别为:MT814835（xyn ZT-1）、MT814836（xyn ZT-2）、MT814837（xyn ZT-3）。3.对3种木聚糖酶基因分析,结果显示:xyn ZT-1、xyn ZT-2、xyn ZT-3序列全长分别为831 bp、1026 bp、2967 bp;成熟肽分别编码氨基酸个数为247-aa、342-aa、989-aa;分别属于GHF11、GHF43、GHF10。4.成功构建产木聚糖酶重组菌,重组菌分别命名为BL21/xyn ZT-1、BL21/xyn ZT-2、GS115/xyn ZT-3,验证工程菌成功异源表达,并对发酵条件进行优化,在最佳发酵条件下,最终得到酶活力分别为0.198 U/m L、0.187 U/m L、1.430 U/m L。5.通过镍柱纯化获得重组木聚糖酶纯酶,并对其酶学性质测定。3种重组木聚糖酶最适反应温度均为45℃;当温度高于50℃时,Xyn ZT-1和Xyn ZT-3酶活力迅速下降,甚至丧失;Xyn ZT-2酶活力较稳定。重组酶Xyn ZT-1的最适p H为5.0,而Xyn ZT-2和Xyn ZT-3的最适p H都是6.0;Xyn ZT-1的p H稳定性较好。结论1.从黑曲霉菌株中获得的3种编码木聚糖酶核苷酸序列,在枯草芽孢杆菌WB600中成功表达。2.从麦氏交替单胞菌全基因组中得到3种编码木聚糖酶核苷酸序列,获得3段木聚糖酶基因xyn ZT-1、xyn ZT-2、xyn ZT-3,丰富了木聚糖酶的新酶种。3.将序列分别在大肠杆菌BL21（DE3）以及毕赤酵母GS115中异源表达,并获得重组木聚糖酶纯酶,确定重组酶的特性。
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