棉花是世界上最重要的经济作物之一,棉花纤维是全球经济的基础和纺织业的支柱,其他副产品可以作为牲畜饲料、棉籽油、肥料、纸张及其他消费品,另外,棉花可以作为一种理想的植物,对基因组进化、多倍体化和单细胞生物学等进行不同的生物学研究。MYB转录因子包含一个MYB域,由52个氨基酸基序的4个不完全重复序列组成,该转录因子在保卫细胞信号转导中起着重要作用。AtMYB44是一种多面转录因子,主要与拟南芥乙烯信号通路相关。APETALA2/乙烯反应因子(AP2/ERF)是植物特异性转录因子(TFs)的一个超家族,它在调节植物器官发育,不同环境和生物胁迫的反应中起着至关重要的作用。NB-ARC结构域是一种调节程序性细胞死亡的STAND(信号转导多个结构域的ATP酶)蛋白,能够与ATP结合进行水解并诱导下游阻力信号传导。基因组编辑(GE)是通过编辑不同生物的基因组序列从而改变生物特性的一种方法。近年来,从简单到复杂的基因组,人们已经探索了各种各样的基因编辑工具,CRISPR(成簇的有规律的间隔的短回文重复序列)是最新并且功能最为强大的一种编辑技术,它的应用彻底改变了科学界。CRISPR/CAS9是一种RNA引导的核酸内切酶,通过核苷酸碱基配对明确靶向DNA序列。它具有效率高、操作方便、编辑准确等特点,被认为是转基因技术在作物、水果、蔬菜等各种生物中最为有效的技术之一,可以用于基因改造、基因敲除、插入、激活和抑制靶标基因。然而,我们对CAS9特异性的理解及编辑功能的认识在植物中非常有限。为了研究昆虫应激条件下GhMYB44,GhAP2,和GhARC基因的功能,构建了它们的CRISPR/Cas9敲除载体,同时还构建了GhMYB44在棉花中的过量表达载体。亚细胞定位分析发现GhMYB44定位在细胞核中。表达量分析发现GhMYB44,GhAP2,和GhARC这3个基因昆虫应激条件下的表达量都发生了变化。对敲除了这三个基因的棉花后代通过PCR,RT-PCR,BarCodes,T7E1,和HiTOM等方法进行了鉴定,突变表现为核苷酸的插入和缺失,基因编辑频率为80-100%。同时,通过PCR,RT-PCR,和Southern blot等方法对过表达的GhMYB44棉花后代进行鉴定。相比对照,GhMYB44,GhAP2,和GhARC基因的敲除株系均表现植株变矮,叶子和花瓣变小,叶片颜色变淡的特征,相比敲除株系,过表达株系表现花瓣变大,植株变高的特点,但是比野生型植株要矮小。最后,为了鉴定敲除载体在转基因植株中的编辑效率和脱靶效应,采用全基因组测序(WGS)方法对3个基因的14株敲除植株后代,3个阴性对照植株和3个野生型植株进行分析。与野生型,阴性对照和棉花参考基因组序列对比,共检测到4,188–6,404个SNP和312–745个插入/缺失。由于这些变异中的大多数都缺少一个相邻的间隔基序(PAM),证明4413个潜在的脱靶位点(sgRNA序列上错配数≤5的位点)经CAS9编辑后的大多数变异是由于母体植物的体细胞变异,本身存在的或者自然变异所致,并不是脱靶效应。数据表明仅仅有4个真实的脱靶缺失位点,并且通过Sanger测序方法进行了验证。此外,野生型植株本身的遗传变异可产生新的脱靶位点并破坏PAMs,这就意味着在设计sgRNA时应该格外小心,尽量减少脱靶效应的影响。这些结果表明CRISPR/CAS9系统对棉花具有高度的特异性,同时本研究也拓展了我们对昆虫应激反应机制的认识。