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本论文包括3部分: 1.猪肺巨噬细胞标准化cDNA文库的构建 巨噬细胞具有吞噬外来颗粒、产生细胞因子和抗原提呈等多种功能。在抗病原微生物感染过程中,巨噬细胞与病原微生物的相互作用如何,人们仍所知甚少。因此,为进一步研究微生物与巨噬细胞之间的相互作用奠定基础,构建了一个巨噬细胞的酵母双杂交cDNA文库,即建立一种研究资源平台。然后运用酵母双杂交技术,筛选文库中与病原微生物致病因子相互作用的蛋白,从而进一步探讨病原微生物在感染过程中与巨噬细胞相互作用的机理。 本实验中,分离纯化了健康小猪肺巨噬细胞的原代细胞。提取细胞的RNA,用SMART技术反转录为cDNA。去除cDNA短片段,消除cDNA丰度差异,将cDNA转化酵母,建立了猪肺巨噬细胞的酵母双杂交标准化cDNA文库。并对文库的质量进行了鉴定。其结果显示,构建的文库中插入片段大小平均约1.3KB,片段多态性分布良好,文库的转化克隆子数目大于1×10~6,调整后的滴度达到1×10~8,有良好的质量满足酵母双杂交筛选目的蛋白的需要。 2.胸膜肺炎放线杆菌apxⅢ诱饵质粒的构建 外毒素是胸膜肺炎放线杆菌的主要致病因子之一。它与胸膜肺炎放线杆菌的致病力有重要关系。ApxⅢ具有较强的细胞毒性作用,本实验克隆了胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxⅢ中420aa-680aa的基因序列到pGBK-T7载体中,构建了胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA诱饵质粒,并在酵母中表达了该诱饵蛋白。该诱饵蛋白可用于酵母双杂交进行筛选,为找到该毒素与猪肺巨噬细胞相互作用的蛋白打下了基础。 3.猪常见的5种呼吸道疾病多重PCR诊断方法的建立 近年来,养猪业中呼吸道疾病日益突出,呼吸道疾病的发生呈现多重感染或混合感染从而使病情复杂化的新特点。引起猪呼吸道疾病的细菌性病原微生物主要有五种:胸膜肺炎放线杆菌(APP)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪肺炎支原体(Mph)、支气管败血波氏杆菌(Bb)和多杀性巴氏杆菌(Pm)。它们分别导致猪传染性胸膜肺炎,猪革斯氏病,猪气喘病和猪传染性萎缩性鼻炎等疾病,这些呼吸道疾病的流行,给世界养猪业带来严重的经济损失。准确诊断单一病原或多重病原感染大大有利于疾病的控制。然而,我国目前尚无用于检测上述疾病的混合感染的方法。 本实验根据Genebank上公布的猪胸膜肺炎放线杆菌特异性apxⅣ基因、猪产毒多杀巴氏杆菌toxA基因、猪波氏杆菌fla基因、副猪嗜血杆菌16S rRNA基因和猪肺炎支原体P36基因,设计PCR引物,进行多重PCR检测。经过条件优化,该方法能扩增出预期的377bp(APP),422bp(Pm),235(Bb),287(Mph),821bp(HPS)片段。其敏感度分别为1.0×10~3(APP),1.0×10~3(Pm),1.0×10~3(Bb),5.0×10~2(Mph),5.0×10~2(HPS)CFU。而用其它细菌均未扩出条带,显示了很好的特异性。分别用APP、Bb、HPS