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硫化氢(H2S)是一种无色、易燃的酸性气体,具有明显的毒性。多年来的认识主要局限于其毒性作用。但是近年来的研究发现,硫化氢在哺乳动物体内广泛存在,而且具有重要的细胞保护作用。其主要的合成酶,胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cysta-thionine-γ-lyase,CSE)在哺乳动物的不同组织内广泛表达,但是有分布的差异。比如,神经细胞以CBS为主要分布,而心血管系统则主要以CSE为主要分布,在消化道内,结肠、肝脏主要以CSE为要分布。近年来的研究认为,内源性的H2S是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三种气体信号分子,广泛参与了机体的多种生理与病理过程。例如,H2S调节线粒体内ATP的生成;此外,H2S通过激活ATP敏感的钾通道调节胰岛素分泌,参与糖尿病的发生发展过程;H2S还可以通过影响ATP敏感的钾通道在心血管系统以及呼吸系统发挥作用,尤其H2S在对抗缺氧缺血引起的心肌损伤中的作用日益受到重视。一方面,H2S激活蛋白激酶C及肌膜ATP敏感钾通道,保护大鼠心脏对缺血-再灌注引起的损伤;另一方面,H2S能促进大鼠心肌细胞增殖、血管的平滑肌细胞的增殖迁移。 在消化道,食物的机械性消化依赖于消化道的运动,包括蠕动、分节运动等运动形式,而消化道运动的主体是消化道平滑肌,本身的张力是消化道运动的基础。消化道平滑肌除了受外来神经、肠神经和体液因素调节之外,也可以通过自身调节机制保持其紧张度。例如,细胞内的各种生物活性分子,如H2S、NO等可能是自身调节机制的重要的活性分子。已有研究证实,胃肠道的黏膜、肠神经和平滑肌组织均有CBS和CSE分布,可以产生内源性的H2 S;此外,结肠内的细菌分解消化产物的过程中会产生H2S。因此,阐明H2S调控胃肠道运动及其机制具有重要的生理学以及潜在的临床意义。 本文主要通过电生理学以及分子生物学的方法,研究H2S在小鼠胃底平滑肌运动调控中的作用及其机制。首先,我们研究了H2S对平滑肌经典钙依赖性收缩途径——兴奋收缩耦联的影响:利用免疫组织化学的方法检测了H2S合成酶在小鼠胃平滑肌细胞上的表达情况;采用离体肌条实验检测H2S对离体肌条张力的影响;采用细胞内记录的方法检测H2S对平滑肌细胞膜电位的影响;采用全细胞膜片钳的方法检测H2S对单个平滑肌细胞电压依赖性钾通道以及L-型钙通道电流的影响;采用钙荧光成像技术检测H2S对细胞内钙离子浓度的影响。其次,探讨了H2S对NO生成的影响及其作用机制:利用免疫组织化学的方法检测H2S合成酶和NO合成酶在小鼠胃平滑肌细胞上的表达情况;采用电化学的方法直接检测组织内H2S和NO的生成情况;采用离体肌条实验检测H2S和NO对离体肌条张力的影响;采用蛋白免疫印迹方法检测H2S对NO合成酶活性的调节,同时利用siRNA干扰细胞内H2S生成,检测其对NO合成酶活性的调节及其调节机制。 研究结果如下: 一、H2S对小鼠胃底平滑肌运动的调控及其离子机制 1.蛋白免疫印迹结果显示,在培养的小鼠胃底平滑肌细胞均有表达H2S合成酶CBS和CSE蛋白。 2.离体肌条收缩实验结果显示,NaHS(H2S供体)可以剂量依赖地增加胃底平滑肌张力;当给予CBS阻断剂AOAA时,其张力降低,而NaHS可以逆转AOAA的降低张力的作用;SNP(NO供体)降低平滑肌张力,而NOS阻断剂L-NAME,则其张力升高。然而,CSE阻断剂PAG,则几乎不影响其张力的变化。选用电压依赖性钾通道特异性阻断剂4-AP和L-型钙通道的阻断剂尼卡地平预处理,均可以阻断NaHS对平滑肌的兴奋性作用。 3.细胞内记录结果显示,NaHS可以使胃底平滑肌细胞膜电位发生去极化。 4.全细胞膜片钳实验结果显示,NaHS可以降低电压依赖性钾通道的电流,增加L-型钙通道的电流。 5.钙荧光成像实验结果显示,NaHS可以增加细胞内游离钙浓度,而这种增加作用可被L-型钙通道的阻断剂尼卡地平阻断。 以上结果提示:(1)内源性的H2S可以增加胃底平滑肌细胞的张力;(2) H2S降低了电压依赖性钾通道电流使细胞膜去极化,进而激活了L-型钙通道,使钙离子内流增加,最终使得平滑肌张力增加。 二、H2S对小鼠胃底平滑肌NO合成的作用及其机制 1.蛋白免疫印迹的结果显示,在培养的小鼠胃底平滑肌细胞均有表达H2S合成酶CBS和CSE蛋白以及NO合成酶eNOS和nNOS蛋白。 2.离体肌条收缩实验结果显示,NaHS可以增加胃底平滑肌张力,SNP可以降低胃底平滑肌的张力,而NaHS可以部分逆转SNP诱导的平滑肌张力降低作用;HNO可以显著降低胃底肌条的张力,而作为阴性对照的KOH对张力并没有显著性的变化;NO合酶阻断剂L-NAME可以削弱NaHS诱导的平滑肌张力增加效果。 3.电化学结果显示,在胃底平滑肌组织中可以实时检测到H2S和NO的生成;当NO生成量稳定后,给予CBS合成酶抑制剂AOAA,可以显著增加NO的生成效率。 4.免疫蛋白印迹实验结果显示,NaHS可以降低eNOS合酶的丝氨酸1177位点的磷酸化水平,降低Akt酶丝氨酸308位点、苏氨酸473位点的磷酸化水平;PI3K阻断剂LY294002可以阻断NaHS降低eNOS合酶的丝氨酸1177位点的磷酸化水平的作用;CBS阻断剂AOAA可以增加eNOS合酶的丝氨酸1177位点的磷酸化水平,增加Akt酶丝氨酸308位点、苏氨酸473位点的磷酸化水平;给予CBSsiRNA干扰48小时之后,eNOS合酶的丝氨酸1177位点的磷酸化水平增加,Akt酶丝氨酸308位点、苏氨酸473位点的磷酸化水平增加;eNOS蛋白的表达总量有增加,但Akt激酶的总量未有显著性变化。 以上结果提示:(1)在胃底平滑肌,H2S和NO的合酶均有表达,并且可以稳定地生成H2S和NO;(2) H2S可以增加胃底的张力,NO降低胃底的张力,H2S通过PI3K/Akt途径使eNOS酶活性降低,进而增加平滑肌张力。 三、结论 以上两部分的实验可以归纳为以下几点: 1.在小鼠胃底,平滑肌组织可以利用CBS和CSE合酶产生H2S,也可以利用eNOS和nNOS产生NO,两种气体信号分子对胃底平滑肌张力起相反的作用; 2.H2S对平滑肌的兴奋作用通过影响经典的钙依赖途径即兴奋收缩耦联来实现; 3.H2S也可通过PI3K/Akt途径使eNOS酶活性降低减少NO的合成来增加胃底平滑肌张力。