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研究背景肾细胞癌(RCC)是成人肾脏中最常见的恶性肿瘤,发病率约占美国所有成人恶性肿瘤的3-5%,并且在过去几十年中不断呈现上升趋势。肾癌的早期诊断与良好的预后呈正相关。但因为肾细胞癌的早期临床症状如腰部疼痛、肿块和血尿等对早期诊断无效,所以多达30%的肾癌患者在最初被诊断时就已经进展为转移期。近几年来,各研究团体在肾癌分子肿瘤生物学方面的取得了新的进展并将许多新的靶向治疗药物应用于临床,如索拉非尼、舒尼替尼和西罗莫斯等,靶向药物可以明显改善肾癌患者预后并延长患者存活时间。然而,尽管取得了这些重大进展,晚期肾癌仍预后不良,其5年生存率不足20%,这表明寻找新的治疗方法仍是现阶段研究的迫切需要。Porcupine(PORCN)作为一种棕榈酰基转移酶,在Wnt蛋白的活化和分泌过程中起着至关重要的作用,PORCN存在于内质网中,将棕榈油酰辅酶A添加到Wnt蛋白的丝氨酸上活化Wnt蛋白进而激活Wnt信号通路,但PORCN对肾透明细胞癌(ccRCC)具体起到怎样的作用目前仍缺乏相关系统研究。在本研究中我们利用实时定量PCR技术探索了肾癌细胞系以及正常肾上皮细胞系之间PORCN的表达差异,然后又应用免疫组织化学技术探索了在肾透明细胞癌患者中肾癌癌组织和癌旁组织之间PORCN蛋白表达的差异,并进一步利用生物信息分析技术探索了 PORCN的高低表达对肾癌患者预后的影响,体外实验验证了 PORCN抑制剂LGK974对肾癌细胞的增值、凋亡、迁移、侵袭和周期的影响以及LGK974发挥作用所经过的细胞内信号通路。研究目的:1.明确肾癌细胞系786-O、A498、ACHN、CAKI和正常肾上皮细胞系HK-2中PORCN的RNA表达差异以及肾透明细胞癌组织和癌旁组织之间PORCN的蛋白表达差异。2.利用生物信息学分析技术探索在肾癌患者中PORCN表达的高低对预后的影响,并找到与PORCN最相关的10个基因然后进一步对其进行突变分析、通路分析和共表达分析。3.明确PORCN抑制剂LGK974对肾癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响。4.对生信分析中找到的PORCN发挥作用的通路进行进一步验证。研究方法:1.通过实时定量PCR检测肾癌细胞系786-O、A498、ACHN、CAKI和正常肾上皮细胞系HK-2之间PORCN的RNA表达差异,应用石蜡包埋切片技术处理取自临床的肾癌患者标本,并应用免疫组织化学技术检测癌组织和癌旁组织中PORCN的蛋白表达差异。2.应用Human Protein Atlas网站分析PORCN的高低表达对肾癌患者预后的影响。3.利用STRING网站找到与PORCN最相关的10个基因,随后利用WebGestalt网站进行GO分析、KEGG分析,利用cbioportal网站进行突变分析、共表达分析。4.通过CCK8细胞增殖实验证明PORCN抑制剂LGK974对ccRCC细胞增殖影响。5.通过克隆形成实验证明PORCN抑制剂LGK974对ccRCC细胞增殖及克隆形成能力影响。6.通过流式细胞技术证明PORCN抑制剂LGK974对ccRCC细胞凋亡以及周期的影响,并利用Western Blot技术检测PORCN抑制剂LGK974对凋亡相关蛋白和周期相关蛋白表达的影响。7.通过划痕实验、Transwell实验验证PORCN抑制剂LGK974对ccRCC细胞迁移能力和侵袭能力的影响,并利用Western Blot技术检测PORCN抑制剂LGK974对EMT相关蛋白表达的影响。8.利用Western Blot技术和实时定量PCR技术检测PORCN抑制剂LGK974对ccRCC细胞质内β-catenin以及Wnt信号通路靶基因cyclinD1、c-Myc蛋白表达水平的影响以及对MMP9和MMP2RNA表达水平的影响。9.数据表示为平均值±SEM,采用Prism Graphpad软件进行统计分析,使用t检验或单因素方差分析进行统计学比较。*表示p<0.05;**表示p<0.01;***表示 p<0.001。研究结果1.PORCN在部分肾癌细胞系以及肾癌组织中高表达并且PORCN高表达的患者预后不良。2.通过生信分析发现与PORCN最相关的基因即Wnt通路相关基因,通路分析表明PORCN及其最相关基因富集于Wnt通路,而且PORCN与Wnt通路相关基因在肾癌中存在不同程度的突变以及共表达关系。3.通过CCK8实验证明PORCN抑制剂LGK974以时间依赖性和浓度依赖性的方式杀伤肾癌细胞,抑制其增值能力,克隆形成实验证明PORCN抑制剂LGK974可以抑制肾癌细胞集落形成能力。4.通过流式细胞技术证明PORCN抑制剂LGK974可以诱导肾透明细胞癌细胞凋亡,Western Blot实验显示LGK974可以上调Bax,下调Bc12,从而诱导ccRCC细胞凋亡。5.划痕实验表明PORCN抑制剂LGK974可以抑制肾透明细胞癌细胞的迁移能力,Transwell实验再一次表明LGK974可以抑制肾透明细胞癌细胞的迁移和侵袭能力。Western Blot实验显示LGK974可以降低间质标志物的表达水平。6.Western Blot实验显示PORCN抑制剂LGK974可以降低细胞质内β-catenin以及Wnt信号通路靶基因cyclinD1、c-Myc的表达水平,实时定量PCR证明LGK974可以降低MMP9和MMP2的表达水平。结论PORCN在部分肾癌细胞系以及肾癌组织中高表达。PORCN抑制剂LGK974可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期。进一步分析表明,LGK974可下调Wnt/β-catenin信号通路的活性。这些数据也为靶向PORCN下调肾细胞癌Wnt/β-catenin信号通路的可行性提供了证据,并揭示了 PORCN作为治疗肾癌的潜在靶点的可能性。