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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.a）,又称绿脓杆菌,是一种常见的人畜共患条件性致病菌。在饲养管理不当、环境恶劣、注射疫苗等一系列应激下,P.a在兽医临床的分离率呈现逐年上升趋势。该菌对多种抗生素耐药,究其原因主要是极易形成生物被膜（biofilm,BF）,也常作为生物被膜研究的模式菌株。抗微生物肽（Antibacterial peptides,AMPs）一般由5-100个氨基酸短肽链组成的寡肽,AMPs具有广谱抗菌活性和不易产生耐药性,被誉为替代抗生素的候选药物。前期研究中,我们发现鼠源抗微生物肽CRAMP对P.a标准野生株PAO1成熟生物被膜有明显的清除作用,本课题开展了CRAMP的生物活性研究,主要包括初步安全性和稳定性评价、抗生物被膜活性研究,以及采用转录组RNA-Seq技术探究了CRAMP清除P.a标准野生株PAO1成熟生物被膜的作用机制,为最终阐明其作用机制和开发新型抗生物被膜药物奠定了理论基础。1、抗微生物肽CRAMP初步稳定性和安全性评价为了考察CRAMP的稳定性,考察了温度、酶、金属离子和酸碱梯度对其抗菌作用的影响。结果表明,CRAMP对PAO1最小抑菌浓度（MIC）为15.625μg/mL;温度（25-100℃）、两种盐离子（Na+、K+）和pH值为5-10对其抗菌活性没有影响,但pH值为3-4、二价盐离子Ca2+和蛋白酶均不同程度影响了CRAMP的抗菌活性。为了考察CRAMP的安全性,将CRAMP（62.5-500μg/mL）与4%兔子红细胞悬液等体积混合,测定溶血率;根据LDH Cytotoxicity Assay Kit试剂盒方法测定CRAMP对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性。结果显示,CRAMP在所测试浓度下对兔溶血率均在2%以下;试验浓度范围在62.5-125μg/mL时CRAMP对RAW264.7没有细胞毒性,当浓度大于250μg/mL时CRAMP对RAW264.7具有细胞毒性。2、抗微生物肽CRAMP对PAO1成熟生物被膜的影响根据预试验结果,分别在不同培养体系中构建了72h的PAO1成熟生物被膜。在96孔细胞培养板中,采用结晶紫染色法检测生物被膜量,并设置人源抗微生物肽LL-37为对照组,筛选出了最佳的CRAMP干预条件。然后在6孔细胞培养板和T25细胞培养瓶中构建成熟生物被膜,最佳干预浓度的CRAMP作用1h后,采用结晶紫染色法检、平板菌落计数法和噻唑蓝（MTT）法检测生物被膜量、活菌数和细菌活力,采用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察CRAMP干预PAO1生物被膜形态学的变化。结晶紫染色法结果显示:96孔板中,CRAMP组生物被膜量减少率为56.09%（P<0.01）,LL-37组生物被膜量减少率为46.76%（P<0.05）,6孔板中,CRAMP组生物被膜量减少率为67.07%（P<0.001）,LL-37组生物被膜量减少率为52.23%（P<0.05）,T25细胞培养瓶中生物被膜量减少率为70.45%（P<0.001）。菌落计数结果显示:6孔板,CRAMP减少0.87个Log10CFU/well,LL-37减少率为0.30个Log10CFU/well,T25细胞培养瓶中,CRAMP减少了0.79个Log10CFU/well。MTT试验结果显示,CRAMP和LL-37均降低了PAO1生物被膜细菌活性,但差异均不显著。CLSM结果显示:与对照组相比较,CRAMP组显著减少了细菌总荧光强度（PI+SYTO,P<0.05）,减少率为58.40%,LL-37组的细菌总荧光强度减少率为21.82%（P>0.05）。与对照组相比,CRAMP组的死菌荧光强度占细菌总荧光强度比值（PI/PI+SYTO）极显著上升（P<0.001,升高率为64.10%）,LL-37组上升了36.36%（P<0.05）。上述结果表明,CRAMP显著清除了PAO1生物被膜的总量,对生物被膜活菌有显著的抑杀作用,且效果优于LL-37。3、转录组RNA-Seq技术探究CRAMP清除PAO1成熟生物被膜的作用机制利用Illumina二代高通量测序平台,采用PE150测序策略分析了CRAMP干预PAO1生物被膜与对照组在转录水平的基因表达差异,并选取了12个差异表达基因进行q RT-PCR验证。结果显示,CRAMP干预PAO1生物被膜后,共有2914个差异表达基因（1489个上调,1425个下调）,GO功能分析主要集中在代谢过程相关的功能组,KEGG功能分析主要集中在代谢途径、氧化磷酸化等通路以及生物被膜调控系统等;利用q RT-PCR验证12个与生物被膜相关的差异表达基因,有9个基因与RNA-Seq结果趋势一致,即75%的一致性,表明高通量测序结果具有可信性。4、抗微生物肽CRAMP对PAO1生物被膜藻多糖含量的影响通过转录组学研究结果发现,与藻多糖合成的相关基因显著下调,结合前述的表型分析,CRAMP清除PAO1成熟生物被膜的作用与胞外多糖（EPS）主要成分藻多糖密切相关。为了进一步验证其作用机制,采用了1.3-间萘二酚方法检测生物被膜中藻多糖的含量,结果显示,经CRAMP作用后,PAO1生物被膜藻多糖的含量极显著降低,减少率高达70.06%。综上所述,抗微生物肽CRAMP具有较高的稳定性（除酶稳定性外）,无溶血性和低细胞毒性;对P.a成熟生物被膜具有明显的清除作用,并与藻多糖的合成减少密切相关。