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目的:糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)作为2型糖尿病的常见微血管并发症,随着糖尿病(diabetes mellitus,DM)患病率的急剧增加,目前已成为导致终末期肾病的首位病因。因此早期诊断和治疗意义重大。糖耐量异常(impaired glucose tolerance,IGT)是糖尿病前期的重要发展阶段,同时也是DM微血管并发症的独立危险因素。本课题组前期动态观察了 2型糖尿病发病不同阶段肾脏病变的发生情况,发现IGT期大鼠模型已出现不同程度的肾脏结构和功能损伤,主要以肾小管微循环障碍为主,其具体机制有待进一步研究。肾小管周围微循环障碍的早期表现主要为内皮细胞功能损伤,血管内皮细胞是肾脏微循环的重要组成部分,是对抗致病因素的“第一道防线”。糖耐量异常期的主要特点为胰岛素抵抗及代偿性高浓度胰岛素血症,代偿性升高的胰岛素可能通过PI3K/AKT与MAPK/ET-1通路两条信号通路调节内皮细胞血管舒缩活性物质释放,导致NO合成减少,ET-1过度分泌,引起肾小管微循环障碍。因此,IGT期代偿性高胰岛素分泌造成的血管内皮细胞舒缩功能障碍可能是IGT期肾损伤重要致病机制。多种microRNA与DKD的发病相关,其中miR-21在糖尿病前期患者和胰岛素抵抗动物模型中出现明显表达改变,并参与胰岛素信号通路调节。因此,miR-21可能通过参与胰岛素信号通路,介导高浓度胰岛素血症造成的内皮细胞功能障碍。因此我们提出实验假说:高浓度胰岛素/高浓度葡萄糖干预下肾小管周围毛细血管内皮细胞通过影响miR-21表达,调控下游PTEN/PI3K/AKT/eNOS通路及MAPK/ET-1通路各蛋白表达,引起内皮细胞分泌、增殖功能紊乱。本实验以肾小球内皮细胞为研究对象,观察在高浓度胰岛素/高浓度葡萄糖干预下肾小球内皮细胞miR-21及下游PTEN/AKT/eNOS和MAPK/ET-1信号通路蛋白的表达,以及IGT期OLEFT大鼠主动脉组织中的miR-21及下游通路蛋白的表达量;同时检测在高浓度胰岛素/高浓度葡萄糖干预下肾小球内皮细胞NO和ET-1的分泌量及内皮细胞增殖,迁移能力变化,并通过转染miR-21 mimics或inhibitor研究miR-21对下游通路蛋白和内皮细胞功能的影响,以探讨IGT期肾损伤的可能发病机制。方法:1.以肾小球内皮细胞为研究对象,应用qRT-PCR观察不同浓度葡萄糖(5.5m mol/L、8.3mmol/L、11.1mmol/L、16.7mmol/L、33.3mmol/L)或不同浓度胰岛素(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml)干预肾小球内皮细胞时,miR-21表达量随时间(Oh、12h、24h、36h、48h、72h)和浓度的变化。2.应用 western blot 法观察不同浓度葡萄糖(5.5mmol/L、16.7mmol/L、33.3 mmol/L)或不同浓度胰岛素(Ong/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml)干预 48 h后,miR-21下游PTEN/AKT/eNOS通路和MAPK/ET-1通路蛋白表达变化。3.转染miR-21 mimics或inhibitor进行功能获得性和功能缺失性研究,以探讨miR-21在调控PTEN/AKT/eNOS和MAPK/ET-1通路中的作用。4.同时给予不同浓度葡萄糖和胰岛素干预:葡萄糖浓度8.3mmol/L或葡萄糖浓度 33.3mmol/L+不同浓度胰岛素(Ong/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml)干预肾小球内皮细胞48h,观察miR-21及下游PTEN/AKT/eNOS通路和MAPK/ET-1通路蛋白表达量变化。5.以IGT期OLEFT大鼠主动脉组织为研究对象,应用qRT-PCR观察IGT组和正常组miR-21表达量;western blot法观察两组PTEN/AKT/eNOS通路和MAPK/ET-1通路蛋白表达量;6.硝酸还原酶法观察不同浓度葡萄糖(5.5mmol/L、16.7mmol/L、33.3mmol/L)或不同浓度胰岛素(Ong/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml)干预48h对肾小球内皮细胞NO分泌的影响;转染miR-21 mimics或inhibitor探讨miR-21对调节NO分泌的作用。7.ELLSA 法测定不同浓度葡萄糖(5.5mmol/L、16.7mmol/L、33.3mmol/L)或不同浓度胰岛素(Ong/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml)干预48h对肾小球内皮细胞ET-1分泌的影响;转染miR-21 mimics或inhibitor探讨miR-21对调节ET-1分泌的作用。8.细胞划痕实验观察葡萄糖浓度33.3mmd/L或胰岛素浓度50ng/ml干预48h对肾小球内皮细胞增殖和迁移能力的影响。转染miR-21 mimics或inhibitor研究miR-21在调节内皮细胞增殖和迁移能力的作用。结果:1.高浓度葡萄糖干预对肾小球内皮细胞miR-21表达、PTEN/AKT/eNOS和MAPK/ET-1通路活性及肾小球内皮细胞功能的影响1.1.与5.5mmol/L正常葡萄糖浓度组比,16.7mmol/L、33.3mmol/L葡萄糖浓度组肾小球内皮细胞miR-21表达明显上调,且miR-21的表达量随葡萄糖浓度的升高逐渐升高;高浓度葡萄糖对miR-21表达的影响呈时间依赖性,从24h开始升高,于48h达到表达高峰。1.2.与5.5mmol/L葡萄糖浓度组比,16.7mmol/L、33.3mmol/L葡萄糖浓度组肾小球内皮细胞中PTEN表达量减少,AKT磷酸化程度升高,eNOS表达量及磷酸化程度升高,P38-MAPK磷酸化程度降低,ET-1表达量降低。1.3.与5.5mmol/L葡萄糖浓度组比,16.7mmol/L、33.3mmol/L葡萄糖浓度组肾小球内皮细胞NO分泌量明显升高,ET-1分泌量明显降低;随葡萄糖浓度升高NO分泌量逐渐升高,ET-1分泌量逐渐降低。与33.3mmol/L葡萄糖浓度组相比,33.3mmol/L+miR-21 inhibitor组肾小球内皮细胞的NO分泌量显著降低,ET-1分泌量明显升高。33.3mmol/L葡萄糖浓度组及33.3mmol/L葡萄糖浓度+miR-21 inhibitor组肾小球内皮细胞迁移速率较正常组未见明显差异。2.高浓度胰岛素干预对肾小球内皮细胞miR-21表达、PTEN/AKT/eNOS和MAPK/ET-1通路活性及肾小球内皮细胞功能的影响2.1.与Ong/ml胰岛素浓素组相比,25ng/ml、50ng/ml胰岛素浓度组miR-21表达显著下调,且miR-21的表达量随胰岛素浓度的升高逐渐降低;高浓度胰岛素对miR-21表达的影响呈时间依赖性,从24h开始降低,于48h达到最低水平。2.2.与Ong/ml胰岛素浓素组相比,25ng/ml、50ng/ml胰岛素浓度组PTEN表达量升高,AKT磷酸化程度降低,eNOS表达量及磷酸化程度降低,P38-MAPK磷酸化程度升高,ET-1表达量增加。2.3.与Ong/ml胰岛素浓素组相比,25ng/ml、50ng/ml胰岛素浓度组肾小球内皮细胞NO分泌量明显降低,ET-1分泌量明显升高;随胰岛素浓度升高NO分泌量逐渐降低,ET-1分泌量逐渐升高。与50ng/ml胰岛素浓素组相比,50ng/ml胰岛素浓素+miR-21 mimics组肾小球内皮细胞的NO分泌量显著升高,ET-1分泌量明显降低。50ng/ml胰岛素浓度组及50ng/ml胰岛素浓素+miR-21 mimics组肾小球内皮细胞迁移速率较正常组未见明显差异。3.miR-21 对 PTEN/AKT/eNOS 通路和 MAPK/ET-1 通路的影响3.1.与33.3mmol/L葡萄糖浓度组相比,33.3mmol/L葡萄糖浓度+miR-21 inhibitor组肾小球内皮细胞PTEN的表达量升高,AKT磷酸化程度降低,eNOS表达量及磷酸化程度降低,P38-MAPK磷酸化程度和ET-1表达量升高。3.2.与50ng/ml胰岛素浓素组相比,50ng/ml胰岛素浓素+miR-21 mimics组PTEN的表达量降低,AKT磷酸化程度升高,eNOS表达量及磷酸化程度升高,P38-MAPK磷酸化程度和ET-1表达量降低。4.葡萄糖和胰岛素共同作用对肾小球内皮细胞miR-21及PTEN/AKT/eNOS和MAPK/ET-1通路蛋白表达的影响4.1.8.3mmol/L 葡萄糖浓度+不同胰岛素浓度(Ong/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml)组肾小球内皮细胞miR-21表达随着胰岛素浓度升高逐渐降低,PTEN表达量逐渐升高,AKT磷酸化程度逐渐降低,eNOS表达量及磷酸化程度逐渐降低,P38-MAPK磷酸化程度和ET-1表达量逐渐升高。4.2.33.3mmol/L 葡萄糖浓度+不同胰岛素浓度(0ng/ml、5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml)组肾小球内皮细胞miR-21表达随着胰岛素浓度升高先上升后降低,在胰岛素浓度5ng/ml时,miR-21表达量最高,PTEN表达量达到最低水平,AKT磷酸化程度和eNOS表达量及磷酸化程度达到高峰,P38-MAPK磷酸化程度和ET-1表达量达到最低水平。4.3.IGT期OLETF大鼠主动脉组织中miR-21表达量较正常组明显降低,PTEN表达量升高,AKT磷酸化程度降低,eNOS表达量及磷酸化程度降低,P38-MAPK磷酸化升高,ET-1表达量增加。结论:1.高浓度葡萄糖通过上调miR-21,激活肾小球内皮细胞PTEN/AKT/eNOS通路,促进NO分泌,同时抑制MAPK/ET-1通路,抑制ET-1分泌;但对肾小球内皮细胞增殖、迁移功能未见显著影响;2.高浓度胰岛素通过下调miR-21,抑制肾小球内皮细胞PTEN/AKT/eNOS通路,抑制NO分泌,同时激活MAPK/ET-1通路,促进ET-1分泌;但对肾小球内皮细胞增殖、迁移功能未见显著影响;3.高浓度胰岛素/高浓度葡萄糖共同作用于肾小球内皮细胞时,miR-21的表达量及下游PTEN/AKT/eNOS和MAPK/ET-1通路活性的变化趋势取决于葡萄糖和胰岛素的相对浓度。