研究背景与目的鼻咽癌是中国南方和东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一,具有明显的区域分布特征,与EB病毒关系密切,恶性程度较高,早期即可出现颈部淋巴结转移和远处转移。鼻咽癌的发生可能与基因易感性、环境危险因素、特定饮食习惯和EB病毒感染及突变等因素有关。鼻咽癌的生成涉及多个基因和多条信号通路改变,癌基因的激活与抑癌基因的失活以及它们之间相互作用的失衡是鼻咽癌发生发展的分子基础。因此,鼻咽癌相关重要基因及其介导的信号通路研究将有助于进一步揭示鼻咽癌的发病机理。程序性细胞死亡因子4(programmed cell death4, PDCD4),在诱导细胞凋亡的过程中,该基因表达上调而被命名。PDCD4在人染色体上定位于10q24,由469个氨基酸组成,在正常组织中广泛表达,以肝脏中表达最高。多数研究显不,PDCD4在恶性肿瘤组织中表达下调或缺失,如肺癌、舌癌、肝癌、浸润性乳腺导管癌、皮肤癌及神经胶质瘤等,与恶性肿瘤的进展密切相关,提示PDCD4表达下降或缺失在恶性肿瘤的发生发展过程中可能起重要作用。目前研究表明PDCD4作为一个新的抑癌基因,能够促进凋亡、抑制肿瘤生长、转化及侵袭,但是具体的分子机制目前还不清楚。本课题组前期的研究表明,PDCD4基因在鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞中表达明显下调,可能作为候选抑癌基因参与鼻咽癌的发生发展。但是该基因在鼻咽癌中作用和机制研究目前还未见明确相关报道。microRNA(miRNA)是近年来在生物体内发现的一类内源性的具有调控功能的非编码小RNA,长度约为21-25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的。随后组装进RNA诱导的沉默复合体,通过碱基互补配对的方式识别靶基因mRNA,并降解靶基因或者阻遏靶基因的翻译。研究表明,miRNA在组织器官发育、病毒防御、物质代谢、细胞增殖、细胞分化、凋亡等一系列重要生命活动的调控过程中扮演着重要的角色。此外,miRNA与肿瘤的发生发展密切相关。有研究表明,大约50%以上的miRNA定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragile site),其表达水平在多种肿瘤中易发生变化,通过调控靶基因的转录和翻译,参与肿瘤细胞的增殖、分化、游走、侵袭和转移等过程。PDCD4在鼻咽癌中是否受到miRNAs调控,调控哪些miRNAs的表达,哪些miRNAs又在鼻咽癌中反过来调控PDCD4都是值得我们深入研究的问题。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信号通路是细胞内重要的信号通路之一,参与生长、增殖、分化、凋亡、葡萄糖转运、侵袭转移、血管生成以及细胞外基质的降解等多种细胞功能的调节。Akt是PI3K/Akt信号通路的核心,活化的Akt通过磷酸化激活或者抑制多种酶、激酶和转录因子等下游效应分子,进而调节细胞的功能。研究表明,在多种肿瘤中PI3K/Akt信号通路表达失调,P13K和Akt活性的异常增高与肿瘤细胞的生长、增殖、分化、血管形成、侵袭转移及抗凋亡等生物学行为密切相关。细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。包括G1期、S期(DNA合成期)、G2期、M期(有丝分裂期)以及GO期。细胞周期的正常运行,是在一系列基因相互作用的结果。肿瘤细胞的增殖是失控性生长,因此对于肿瘤细胞周期的研究,尤其是对G0/G1期及G1/S的转化以及调控细胞周期进展的关键基因的研究,将有助于揭示肿瘤的发生发展过程以及肿瘤的防治。细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,在生物的进化及发育、维持内环境的稳定中起着重要的作用。细胞凋亡主要有两条途径：一是膜受体通路,以Fas-FasL为例,Fas是一种跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族成员,它与FasL结合,激活caspase8、3、6、7及PPAR等使细胞发生凋亡。另一个是线粒体凋亡通路,bcl2/bax等凋亡相关蛋白的调节使细胞色素C释放,在胞质中细胞色素C与Apaf-1蛋白形成凋亡小体,然后活化凋亡效应蛋白caspase9、3、6、7及PPAR,最终使DNA断裂细胞凋亡；在细胞凋亡的过程中这些效应蛋白caspases起着关键作用。大量的研究表明,肿瘤的发生发展与细胞凋亡密切相关。基于PDCD4在鼻咽癌中的研究现状,本课题的研究目的是明确PDCD4基因在鼻咽癌中的功能,探讨其与miRNAs的关系及参与的信号转导通路,为鼻咽癌发生发展的分子机制研究提供新思路。研究内容与方法1.PDCD4基因在鼻咽癌组织和细胞中的表达水平检测：包括免疫组化、western blot以及荧光定量PCR检测PDCD4表达水平。2. PDCD4基因对鼻咽癌细胞生物学行为的影响(1)构建过表达PDCD4的慢病毒载体,包装慢病毒感染鼻咽癌细胞5-8F,建立稳定过表达PDCD4的单克隆细胞株。利用MTT实验、平板克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤以及细胞周期与细胞凋亡等实验观察过表达PDCD4后细胞生长、增殖及凋亡能力的变化,进一步确定PDCD4基因在鼻咽癌细胞中的功能。(2)构建靶向PDCD4的shRNA慢病毒干扰载体,包装慢病毒感染鼻咽癌细胞HONE1和SUNE1,建立稳定干扰PDCD4的多克隆细胞株。利用MTT实验、平板克隆形成实验、细胞周期与细胞凋亡等实验观察干扰PDCD4后细胞生长、增殖及凋亡能力的变化,进一步确定PDCD4基因在鼻咽癌细胞中的功能。3.沉默PDCD4基因后miRNA表达谱芯片分析及差异miRNA功能与靶基因验证(1)应用miRNAs表达谱芯片筛选干扰PDCD4后差异表达miRNAs,选取表达差异显著的miR-184用荧光定量PCR进一步验证。(2)以miR-184为研究对象,利用MTT实验以及细胞凋亡实验观察转染miR-184mimics后细胞生长及凋亡能力的变化,明确miR-184在鼻咽癌细胞中的功能；并且利用MTT实验观察稳定干扰PDCD4细胞转染miR-184mimics后细胞生长能力的变化,进一步明确PDCD4与miR-184的关系。(3)利用miRwalk及RNAhybrid等网站预测miR-184的靶基因。(4)构建双荧光素酶报告基因载体psicheck-2/BCL23’UTR和psicheck-2/C-MYC CDS与双荧光素酶报告基因突变载体psicheck-2/BCL2mt3’UTR和psicheck-2/C-MYC mt CDS,分别与miR-184mimics/inhibitor共转染SUNE1细胞,48h后检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性,根据荧光素酶比值确定miR-184是否直接调控BCL2和C-MYC。(4) Western blot检测miR-184mimics/inhibitor转染细胞后BCL2和C-MYC的表达量,进一步确定BCL2和C-MYC是否为miR-184的靶基因。(5) Western blot检测转染miR-184mimics后PDCD4的表达量,明确miR-184是否调控PDCD4的表达。4. PDCD4基因及miR-184在鼻咽癌中抑制细胞增殖与促进细胞凋亡的分子机制研究(1) Western blot检测稳定过表达及稳定干扰PDCD4后细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白PI3K、pPI3K、pAkt、JNK1及C-JUN的表达。(2) Western blot检测瞬时转染P13K抑制剂Ly294002后SUNE1和5-8F细胞的pPI3K、Akt、pAkt及C-JUN等蛋白的表达。(3) Western blot检测稳定过表达及稳定干扰PDCD4后细胞周期相关蛋白C-MYC、CCND1、P-RB(780S)、E2F1、P15、P27及CDK4的表达。(4) Western blot检测稳定过表达及稳定干扰PDCD4后线粒体凋亡通路相关蛋白的表达。(5) Western blot检测瞬时转染miR-184mimics后SUNE1和5-8F细胞中细胞周期相关蛋白C-MYC、CCND1、P-RB(780S)、E2F1、P15及CDK4的表达。(6) Western blot检测瞬时转染miR-184mimics后SUNE1和5-8F细胞中线粒体凋亡通路相关蛋白的表达。5. PDCD4通过介导C-JUN结合miR-184的启动子区而调控miR-184的表达(1)利用siRNA靶向沉默C-JUN,荧光定量PCR检测沉默C-JUN后miR-184的表达量。(2)利用miRBase、Ensembl及TFSEARCH等软件预测miR-184启动子区C-JUN的结合位点。(3)染色质免疫共沉淀验证C-JUN结合miR-184的启动子区。结果1. PDCD4基因在鼻咽癌组织和细胞中的表达水平检测免疫组化结果显示, PDCD4在大部分鼻咽粘膜组织中呈高表达,在鼻咽癌组织中有不同程度的表达,但以低表达为主,差异有统计学意义(χ2=94.635,P<0.001)。提取5例鼻咽癌组织和3例非癌鼻咽组织蛋白质,western blot检测鼻咽癌组织和非癌鼻咽组织中PDCD4蛋白的表达水平,结果显示, PDCD4在非癌鼻咽组织中呈高表达,在鼻咽癌组织中低表达。荧光定量PCR检测鼻咽癌组织和非癌鼻咽组织中PDCD4的表达水平,结果显示,鼻咽癌组织与非癌鼻咽组织中PDCD4的表达差异有统计学意义(t=-28.433,P=0.001)。荧光定量PCR检测永生化鼻咽上皮细胞NP69和8株鼻咽癌细胞株6-10B、HONE1、CNE1、5-8F、SUNE1、HNE1、CNE2、C666-1中PDCD4的表达水平,结果显示,与NP69相比,8株鼻咽癌细胞中PDCD4的表达水平较低,差异有统计学意义(F=101.776,P<0.001)。其中5-8F细胞中PDCD4表达量最低, HONE1和SUNE1两种细胞中PDCD4表达量最高,分别选为下一步过表达PDCD4和干扰PDCD4的实验对象。2. PDCD4基因能够抑制细胞增殖及细胞周期G1到S期转化,并且诱导细胞凋亡(1)稳定过表达PDCD4基因对鼻咽癌细胞生物学行为的影响1)构建过表达PDCD4的慢病毒载体,包装慢病毒后感染5-8F细胞,采用96孔板有限稀释法,挑选只有一个细胞且发绿色荧光的孔作为稳定过表达或空载对照的候选单克隆。并且利用荧光定量PCR及western blot检测过表达单克隆细胞中PDCD4的表达水平,与对照细胞scramble和空白细胞株5-8F相比,clone1和clone2细胞中PDCD4表达量显著升高。2)MTT法检测PDCD4过表达后5-8F细胞存活能力的变化。结果显示,相对于空载细胞株scramble和空白细胞株5-8F,稳定过表达PDCD4后clone1和clone2细胞存活能力明显降低,差异有统计学意义(F=601.052,P<0.001)。3)平板克隆形成实验检测稳定过表达PDCD4后5-8F细胞体外增殖能力的变化。结果显示,相对于空载细胞株scramble和空白细胞株5-8F,稳定过表达PDCD4后clone1和clone2细胞的平板克隆形成能力明显降低,差异有统计学意义(F=36.643,P<0.001)。这提示PDCD4能够抑制细胞体外增殖能力。4)裸鼠皮下成瘤实验检测稳定过表达PDCD4后5-8F细胞体内增殖能力的变化。结果显示,与空载对照组细胞scramble相比,稳定过表达PDCD4的clone1和clone2两组细胞的裸鼠皮下成瘤速度明显减慢,差异有统计学意义(F=35.816,P<0.001)。过表达PDCD4基因后,5-8F细胞在裸鼠体内的生长速度明显减慢,这提示PDCD4能够抑制细胞体内增殖能力。5)流式细胞术检测稳定过表达PDCD4后5-8F细胞周期的变化。结果显示,与scramble相比,稳定过表达PDCD4单克隆细胞,S期细胞比例明显减少,G1期和G2期细胞比例明显增多,差异具有显著性[G1期：F=88.642,P<0.001；S期：F=28.469,P=0.001；G2期：F=18.47,P=0.003]。细胞周期结果表明,稳定过表达PDCD4后,细胞周期G1期到S期转化障碍,从而抑制细胞增殖。6)流式细胞术检测稳定过表达PDCD4后5-8F细胞凋亡的变化。结果显示,与scramble相比,稳定过表达PDCD4单克隆细胞clone1和clone2中细胞凋亡比例明显增多,差异具有统计学意义(F=77.368,P<0.001)。这提示PDCD4能够诱导细胞凋亡。(2)稳定干扰PDCD4基因对鼻咽癌细胞生物学行为的影响1)构建慢病毒干扰载体PLVTHM/PDCD4和阴性对照载体PLVTHM,包装慢病毒后感染HONE1和SUNE1细胞,分别命名为sh1-PDCD4、sh2-PDCD4,及阴性对照多克隆pLVTHM。感染48h后根据细胞的感染效率(GFP+细胞比例)均超过90%,因此可直接进行后续实验。并且用荧光定量PCR及western blot检测稳定干扰PDCD4多克隆细胞中PDCD4蛋白的表达水平,结果显示多克隆细胞中PDCD4表达明显下调,而Sh2-PDCD4多克隆细胞中PDCD4的下调更为显著,选取该多克隆细胞进行后续实验。2)MTT法检测PDCD4干扰后HONE1及SUNE1细胞存活能力。结果显示,相对于空载细胞株sh-scramble,稳定干扰PDCD4后细胞的生长能力明显增强,差异有统计学意义[F=1151.482, P<0.001(HONE1); F=2752.914, P<0.001(SUNE1)]。3)平板克隆形成实验检测检测PDCD4干扰后HONE1及SUNE1细胞体外增殖能力的变化,结果显示,相对于空载细胞株,稳定干扰PDCD4后细胞的克隆形成能力明显增强,差异具有显著性[t=9.879, P=0.001(HONE1); t=24.012, P<0.001(SUNE1)].这提示PDCD4能够抑制细胞体外增殖能力。4)流式细胞术检测稳定干扰PDCD4后HONE1和SUNE1细胞周期的变化。结果显示,与空载细胞株sh-scramble相比,shPDCD4细胞中,S期细胞比例明显增多,G1期和G2期细胞比例明显减少,差异具有显著性[G1期：t=--21.199,P<0.001(HONE1), t=-5.97, P=0.004(SUNE1);S期：t=6.655,P=0.003(HONE1),t=6.292,P=0.003(SUNE1);G2期：t=6.94, P=0.002(HONE1), t=3.773, P=0.02(SUNE1)]。细胞周期结果表明,稳定干扰PDCD4后,细胞周期G1期到S期转化加快,从而促进细胞增殖。5)流式细胞术检测稳定干扰PDCD4后HONE1和SUNE1细胞凋亡情况。结果显示,与空载细胞株sh-scramble相比,shPDCD4细胞,凋亡细胞比例明显减少,差异具有显著性[t=-21.250, P<0.001(HONE1), t=-15.985, P<0.001(SUNE1)]。细胞凋亡结果表明,稳定干扰PDCD4后,细胞凋亡明显减少。3.干扰PDCD4后miRNA芯片表达谱分析及差异miRNA功能与靶基因验证(1)干扰PDCD4后的miRNA表达谱芯片数据表明,miR-184的表达明显下调。采用荧光定量PCR进一步验证,干扰PDCD4后,miR-184的表达明显下调,而过表达PDCD4后,miR-184的表达明显上调。因此我们选择miR-184作为研究对象。(2)miR-184能够抑制细胞生长及诱导细胞凋亡1)MTT法检测miR-184mimics瞬时转染鼻咽癌细胞株SUNE1和5-8F细胞生长曲线。结果显示,相对于control细胞株,瞬时转染miR-184mimics后细胞的生长能力明显减慢,差异有统计学意义[F=99.542, P<0.001(SUNE1);F=201.900,P<0.001(5-8F)]。2)流式细胞术检测miR-184mimics瞬时转染鼻咽癌细胞株后引起的细胞凋亡变化。结果显示,与negative control相比,miR-184mimics瞬时转染SUNE1和5-8F细胞后,凋亡细胞数量明显增多,差异具有统计学意义[t=-7.965,P=0.001(SUNE1), t=18.817, P<0.001(5-8F)]。细胞凋亡结果表明,瞬时转染miR-184mimics后,细胞凋亡明显增多。3)MTT检测miR-184mimics瞬时转染稳定干扰PDCD4鼻咽癌细胞株HONE1和SUNE1细胞生长曲线。结果显示,相对于negative control细胞株,稳定干扰PDCD4鼻咽癌细胞株瞬时转染miR-184mimics后细胞的生长能力明显减慢,差异有统计学意义[F=956.238, P<0.001(sh-PDCD4-HONE1); F=793.964, P<0.001(sh-PDCD4-HONE1)]。这提示miR-184能逆转沉默PDCD4后对细胞生长的促进作用。(3)利用RNAhybrid和miRwalk等软件预测miR-184靶基因为BCL2和C-MYC,并且用双荧光素酶报告基因实验和western blot证实。1)成功构建了psiCHECK-2/BCL2wt3’UTR质粒和psiCHECK-2/BCL2mt3’UTR质粒,分别与miR-184mimics、miR-184inhibitor共转染SUNE1细胞,以psiCHECK-2空载质粒作为对照组,转染48h后检测荧光素酶活性。结果显示,psiCHECK-2/BCL2wt3’UTR和miR-184mimics共转染可明显降低荧光素酶的活性,差异具有统计学意义(t=-33.801,P<0.001),而与miR-184inhibitor共转染可显著增强荧光素酶活性,差异具有统计学意义(t=15.031,P<0.001)。突变质粒psiCHECK-2/BCL2mt3’UTR分别与miR-184mimics和inhibitor共转染后,荧光素酶活性没有明显变化(t=-1.763,P=0.092)。上述结果表明,miR-184能够特异性结合BCL23’UTR。2)成功构建了psiCHECK-2/C-MYC wt CDS质粒和psiCHECK-2/C-MYC mtCDS质粒,分别与miR-184mimics、miR-184inhibitor共转染SUNE1细胞,以psiCHECK-2空载质粒作为对照组,转染48h后检测荧光素酶活性。结果显示,psiCHECK-2/C-MYC wt CDS和miR-184mimics共转染可明显降低荧光素酶的活性,差异具有统计学意义(t=-7.314,P<0.001),而与miR-184inhibitor共转染可显著增强荧光素酶活性,差异具有统计学意义(t=14.943,P<0.001)。突变质粒psiCHECK-2/C-MYC mt CDS分别与miR-184mimics和inhibitor共转染后,荧光素酶活性没有明显变化(t=-1.353,P=0.190)。上述结果表明,miR-184能够特异性结合C-MYC CDS。3) Western blot检测转染miR-184mimics及inhibitor后BCL2及C-MYC蛋白的变化。结果显示,与negative control细胞相比,瞬时转染miR-184mimics后BCL2及C-MYC的表达明显下调,而瞬时转染miR-184inhibitor后BCL2及C-MYC的表达明显上调。4) Western blot检测转染miR-184mimics后PDCD4的表达变化。结果显示,与negative control细胞相比,瞬时转染miR-184mimics后PDCD4的表达不变。结合干扰PDCD4后miRNA表达谱结果及miR-184mimics逆转沉默PDCD4促进细胞生长的作用,可知PDCD4能够调控miR-184的表达,而miR-184却不能反过来调控PDCD4的表达。(4) PDCD4基因及miR-184在鼻咽癌中抑制细胞增殖与促进细胞凋亡的分子机制研究1) Western blot检测稳定过表达及稳定干扰PDCD4后细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白PI3K、pPI3K(Tyr458)、pAkt(Ser473)、JNK1及C-JUN的表达。结果显示,过表达PDCD4后pPI3K、pAkt、JNK1及C-JUN的表达明显下调；干扰PDCD4后pPI3K、pAkt、JNK1及C-JUN的表达明显上调；而PI3K及AKT的表达则无明显变化。2) Western blot检测瞬时转染PI3K抑制剂Ly294002后SUNE1和5-8F细胞的pPI3K(Tyr458)、Akt、PAkt(Ser473)及C-JUN等蛋白的表达。结果显示,瞬时转染PI3K抑制剂Ly294002的细胞pPI3K、pAkt及C-JUN的表达明显下调,而Akt的表达则无明显变化。3) Western blot检测稳定过表达及稳定干扰PDCD4后细胞周期相关蛋白C-MY、CCND1、P-RB(780S、E2F1、P15、P27及CDK4的表达。结果显示,过表达PDCD4后C-MYC、CCND1、P-RB(780S)及E2F1的表达明显下调；干扰PDCD4后C-MYC、CCND1、P-RB(780S)及E2F1表达上调；而P15、P27及CDK4的表达则无明显变化。4) Western blot检测稳定过表达及稳定干扰PDCD4后线粒体凋亡通路相关蛋白的表达。结果显示,过表达PDCD4后Cleaved caspase9、Cleaved caspase3、 Cleaved caspase6、Cleaved caspase7及Cleaved PARP的表达明显上调,BCL2的表达明显下调；干扰PDCD4后Cleaved caspase9、Cleaved caspase3、Cleaved caspase6、Cleaved caspase7及Cleaved PARP表达下调,BCL2的表达明显上调。5) Western blot检测瞬时转染miR-184mimics后SUNE1和5-8F细胞中细胞周期相关蛋白C-MYC、CCND1、P-RB(780S)、E2F1、P15及CDK4的表达。结果显示,转染miR-184mimics后C-MY、CCND1、P-RB(780S)及E2F1的表达明显下调,而P15和CDK4的表达则无明显变化。6) Western blot检测瞬时转染miR-184mimics后SUNE1和5-8F细胞中线粒体凋亡通路相关蛋白的表达。结果显示,转染miR-184mimics后Cleaved caspase9、Cleaved caspase3、Cleaved caspase6、Cleaved caspase7及Cleaved PARP的表达明显上调,BCL2的表达明显下调。(5)PDCD4通过介导C-JUN结合miR-184的启动子区而调控miR-184的表达1)利用siRNA靶向沉默C-JUN,荧光定量PCR检测沉默C-JUN后miR-184的表达。结果显示,沉默C-JUN后miR-184表达明显上调,差异具有统计学意义[1=33.262, P<0.001(SUNE1); t=6.925, P=0.020(5-8F)]2)利用]miRBase、Ensembl及TFSEARCH等软件预测miR-184启动子区C-JUN的结合位点,并且用染色质免疫共沉淀进行验证。结果显示,与,mock相比,转染pcDNA3.1-C-JUN后的染色质片段能结合更多的miR-184启动子区,差异具有统计学意义[t=7.735, P=0.002(P1); t=10.639, P<0.001(P2); t=9.221,P=0.012(P3)]。这提示C-JUN能够结合miR-184的启动子区,从而调节miR-184的表达。结论1.PDCD4在非癌鼻咽组织中高表达,在鼻咽癌组织中低表达。2. PDCD4抑制细胞的生长及增殖能力,抑制细胞周期从G1期到S期转化,诱导细胞凋亡。3.在鼻咽癌中miR-184抑制细胞生长,并且诱导细胞凋亡。4.在鼻咽癌中miR-184的靶基因为BCL2和C-MYC5. PDCD4通过PI3K/Akt信号通路来抑制细胞增殖,通过下调C-MYC、CCND1、 P-RB(780S)及E2F1的表达来抑制细胞周期进展,并能激活线粒体凋亡通路的cleaved caspase9、3、6、7及PARP的表达和下调BCL2的表达来诱导细胞凋亡。6.miR-184能通过靶向C-MYC下调周期相关蛋白CCND1、P-RB(780S)及E2F1的表达来抑制细胞生长,并能通过靶向BCL2激活线粒体凋亡通路的cleaved caspase9、3、6、7及PARP的表达诱导细胞凋亡。7. PDCD4通过PI3K/Akt信号通路介导C-JUN结合miR-184的启动子区来调节miR-184的表达。