【摘 要】
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细胞膜片是指通过细胞膜片技术形成的仅由单层细胞及包含完整细胞外基质（ECM）与细胞-细胞间连接的膜状细胞集合体结构。由于细胞膜片技术可克服传统基于生物材料支架的组织工程方法所存在的宿主反应强和纯细胞悬液注射治疗时的体内转化率低等局限性,该方法已受到组织工程领域的广泛关注。经典的细胞膜片技术通常使用温敏聚合物如聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPA）在较温和的条件下获取细胞膜片,但这种通过表面接枝PNIP
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细胞膜片是指通过细胞膜片技术形成的仅由单层细胞及包含完整细胞外基质（ECM）与细胞-细胞间连接的膜状细胞集合体结构。由于细胞膜片技术可克服传统基于生物材料支架的组织工程方法所存在的宿主反应强和纯细胞悬液注射治疗时的体内转化率低等局限性,该方法已受到组织工程领域的广泛关注。经典的细胞膜片技术通常使用温敏聚合物如聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPA）在较温和的条件下获取细胞膜片,但这种通过表面接枝PNIPA的细胞培养基底通常存在细胞膜片脱落时间较长的问题,而长时间处于较低温度会损害细胞活性,对细胞膜片的完整性与功能造成影响。为解决该问题,通过化学接枝引入-COOH或-OH等亲水基团和使用多孔结构增加基底的水浸润速率已被证明是较好的可加速细胞膜片脱落的改进手段。基于这一策略,本研究提出通过制备丙烯酸（AA）改性的PNIPA与聚己内酯（PCL）混合电纺纤维基底来探究解决上述问题并实现快速形成高质量细胞膜片的可能性。本学位课题研究包括如下两部分:第一部分,首先分别通过本体聚合和自由基聚合方法合成了PNIPA和聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸（PNIPA-AA）,两种聚合物均表现出较好的温敏特性。然后通过电纺丝方法制备了不同比例PNIPA-AA与PCL混纺纤维（9:1;3:1;1:1;1:3,w/w）。SEM观察发现,PNIPA-AA具有较好的可电纺性,在PNIPA-AA中引入PCL可进一步提升可纺性;20?C下接触角测试结果表明随着PCL占比的增加,纤维表面更加疏水,9:1与3:1混纺比例的PNIPA-AA/PCL纤维在30 s内完全水浸润,而1:1与1:3混纺比例的水可浸润性较差;37°C下的纤维降解结果显示,PCL含量的增加能够提高纤维的稳定性,除了混纺比例为9:1的PNIPA-AA/PCL纤维在7 d后较难维持自身稳定性以外,其他三组纤维稳定性均较好。最后通过细胞培养实验优选出最适形成细胞膜片的PNIPA-AA/PCL混纺纤维配比。细胞增殖结果表明不同比例PNIPA-AA/PCL混纺纤维对C3H/10T1/2细胞均有良好的细胞相容性;免疫荧光染色以及蛋白定量检测结果显示,细胞在不同比例PNIPA-AA/PCL纤维上分泌的I型胶原（ColⅠ）无显著性差异,而3:1比例的PNIPA-AA/PCL纤维组总胶原分泌更多。通过免疫荧光和骨架染色观察降温后各纤维基底的细胞脱落能力,发现1:1与1:3混纺比例的PNIPA-AA/PCL纤维上细胞膜片均不能脱落,而9:1与3:1混纺比例能脱落,且残留在基底表面的细胞数较少。综合考虑,可得出混纺比例为3:1的PNIPA-AA/PCL混纺纤维作为细胞膜片制备基底较为合适。第二部分,为进一步印证PNIPA-AA/PCL（3:1）混纺纤维基底形成细胞膜片的有效性,通过旋涂法制备了PNIPA旋涂基底（PNIPA-c）,通过电纺技术制备了PNIPA纤维基底（PNIPA-f）与PNIPA混合PCL的复合纤维基底（PNIPA/PCL,参照文献按最优配比9:1）,进行比较。高温（37?C）与低温（20?C）下水接触角结果表明,PNIPA-AA/PCL（3:1）温敏纤维在37°C下显示出比旋涂基底及其他两组温敏纤维基底更能维持相对疏水状态;20°C下液滴约28s完全浸润基底表面,相比于其他三组基底而言浸润速度更快。细胞活/死与增殖结果显示,四组基底无明显细胞毒性且细胞均能在基底上增殖,第3 d时细胞在PNIPA-AA/PCL（3:1）纤维基底上的增殖能力显著高于其他组。对培养7 d的细胞膜片进行免疫荧光染色发现,PNIPA-AA/PCL（3:1）纤维组细胞间连接紧密,且细胞外基质形成更完整。降温至20°C同时加入预冷的Dulbecco’s磷酸盐缓冲溶液（DPBS）缓冲液进行细胞脱落发现,降温后四组细胞膜片均能脱落,与其余三组基底相比,细胞膜片在PNIPA-AA/PCL（3:1）纤维基底表面分离更彻底,并且分离所需时间也大大缩短（约10 min）,细胞膜片收缩程度更小。将脱落的细胞膜片转移到新组织培养板中并培养2 d后发现,四组细胞膜片均可再黏附增殖,其中从PNIPA-AA/PCL（3:1）纤维基底获取的细胞膜片活力更强。综上,本研究通过制备电纺PNIPA-AA/PCL纤维基底研究了实现快速形成高质量细胞膜片的可行性,所发展的PNIPA-AA/PCL温敏纤维可为快速获取完整细胞膜片的基底设计和制备提供新方法。
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