背景：脊髓损伤是神经系统常见疾病之一。因其病理过程复杂，虽经国内外学者多年的研究，仍缺乏有效的治疗方法，仍是医学界难题。依据对脊髓损伤后病理生理过程的新认识和胡椒碱（Piperine）的药理作用，以及我们先前的研究显示：胡椒碱对脊髓损伤大鼠动物模型具有保护作用，但缺乏大鼠脊髓损伤后神经功能恢复是否与胡椒碱存在量效关系的数据。因此，设计本研究以观察胡椒碱对脊髓损伤后神经功能的保护作用的量效关系，并对其可能的作用机制做进一步的探讨，为临床开发新药提供理论基础。第一部分胡椒碱对大鼠脊髓损伤后肢功能恢复的量效关系观察目的：观察胡椒碱对大鼠急性脊髓损伤后肢功能的恢复与胡椒碱的剂量关系方法：(1)动物来源与分组：将72只成年雄性Wistar大鼠（体重250g-320g）应用随机数字表进行随机分组，分别为假手术组、胡椒碱溶媒组、胡椒碱1组（25mg/kg）、胡椒碱2组（50mg/kg）、胡椒碱3组（75mg/kg）、胡椒碱4组（100mg/kg）、胡椒碱5组（125mg/kg）、胡椒碱6组（150mg/kg），共8组，设编号分别为A,B,C,D,E,F,G,H,每组9只大鼠。(2)动物模型的制作：所有大鼠在胸10水平后入路椎板切除开窗，暴露硬膜囊，假手术组只打开椎板,不撞击脊髓，其余各组均以改良Allen’s法以10g×5cm力撞击脊髓,制造急性脊髓损伤模型。(3)给药方式：造模成功后，假手术组大鼠给予7ml/kg生理盐水灌胃给药，胡椒碱溶媒组大鼠只给予7ml/kg胡椒碱溶媒灌胃给药，胡椒碱组大鼠按实验分组要求给予胡椒碱悬浊液(含7ml/kg胡椒碱溶媒)灌胃给药。每组大鼠都是在术后1d给予灌胃给药，每天一次。(4)大鼠脊髓神经功能测定：术后采用国际通用的BBB行为学评分法(Basso-Beattie-Bresnahan Test)进行评价后肢功能，术后1d评分为0分则纳入实验，表示造模成功，若不是则剔除，剔除的数量再造模补充，于术后3d、7d和14d进行评分，其评分结果作为实验数据。(5)数据统计：本实验的数据应用SPSS13.0统计软件分析，若符合正态分布则以均数±标准差(x±s)表示，否则用中位数表示。多个样本均数比较，若数据符合正态性分布且方差齐则采用one-way ANOVA(F检验)，组间两两比较采用SNK-q法或Dunnet-t法检验，否则采用秩转换的非参数检验的Mann-Whitney U法。定P<0.05为有显著性差异。结果：1根据BBB评分标准，术后1d，除A组没有截瘫外，其他各组均出现瘫痪，评分为0分。术后3d、7d和14d，A组（假手术组）术后无截瘫，评分均为21分；随时间增加B组大鼠后肢功能有所恢复，BBB评分分别是（1.444±0.527，2.333±0.500，7.111±1.054）。其余各组中，相同时间，随着胡椒碱剂量的增加BBB评分值增加，C组BBB评分分别是（2.000±0.707，3.000±0.707，7.778±1.201），D组BBB评分分别是（3.333±0.866，4.111±0.781，9.889±0.781），E组BBB评分分别是（4.778±0.667，6.111±1.269，11.778±1.201），F组BBB评分分别是（6.000±0.707，8.111±0.781，13.778±0.971），G组BBB评分分别是（6.444±0.881，8.777±0.666，14.333±0.707），F组BB评分分别是（7.000±1.118，9.555±1.013，15.111±0.781）。2术后3d、7d、14d， A组与各组比较均有统计学意义（P=0.000,P<0.05）。B组（溶媒组）与各剂量组的比组较中发现，小剂量时无明显作用，大剂量时其作用变化不明显。术后3d、7d、14d，C组(25mg/kg)与B组(溶媒组)比较(p=0.706,P=0.435,P=0.980，P>0.05)差异不明显。当剂量大于50mg/kg时,随着胡椒碱剂量增加差异逐渐明显，B、C、D、E、F组相互比较均有统计学意义（P<0.05）。而剂量大于125mg/kg时随着胡椒碱剂量的增加，其作用效果变化不明显，F组(100mg/kg)与G组(125mg/kg)(P=0.988,P=0.669,P=0.952,P>0.05)，G组(125mg/kg)与H组(150mg/kg)(P=0.989,P=0.684,P=0.490,P>0.05)， F组(100mg/kg)与H组(150mg/kg)(P=0.463,P=0.069,P=0.096,P>0.05)比较，无统计学意义。相同时间，B组与C组、D组、E组比较及其相互比较均有统计学意义（P<0.05）。说明胡椒碱的用量存在最适剂量范围。3根据本实验观察，随着给药剂量的增加，大鼠后肢功能恢复力提高，但是药物的毒性亦增加，在本实验中表现为大鼠生存时间缩短，当胡椒碱剂量大于125mg/kg时，剂量越大，生存时间越短。综合效应与毒性，胡椒碱促进脊髓损伤恢复的最适浓度为50～100mg/kg。结论：（1）经胃灌注一定剂量的胡椒碱对大鼠脊髓损伤后神经功能的恢复具有促进作用，且这种效应与胡椒碱的用量在一定程度上呈剂量依赖关系（2）超大剂量的胡椒碱具有毒性作用，胡椒碱促进脊髓损伤的最适浓度为50～100mg/kg。第二部分胡椒碱对大鼠脊髓损伤后神经功能保护的作用机制研究目的：进一步探讨胡椒碱对大鼠急性脊髓损伤后神经功能保护的作用机制方法：(1)取成年雄性Wistar大鼠（体重250g-320g）48只，分组方法同实验第一部分，但是每组6只大鼠。动物模型的制作、给药方式和数据统计同第一部分。各组于术后3d、7d时各分别随机取3只处死、取材，留取脊髓损伤部位长约5mm的脊髓组织作为病理标本，用4%多聚甲醛液固定48小时，常规石蜡包埋，4℃保存，备用。（2）术后3d、7d、14d的脊髓标本均进行常规HE染色观察其病理变化，用免疫组化检测炎性细胞因子TNF-α、IL-6的含量变化。结果：1脊髓病理HE染色结果术后3d，A组（假手术组）脊髓组织完整，细胞排列整齐，未见明显坏死及空洞，脊髓灰白质界限清楚、神经元及髓鞘结构正常，神经元细胞形态好,数量多,胞膜完整。而其他组均有不同程度的变化,从局部片状出血坏死、周围炎性细胞的浸润、神经元胞体的萎缩、胶质细胞的反应性增生、白质呈网状脱髓鞘。术后7d和14d，A组（假手术组）病理无明显改变，其他各组均有不同程度的好转，随着胡椒碱给药剂量的增加，脊髓损伤区面积逐渐减小而正常组织增多，组织连续性增加，并可见到胶质细胞增生及疤痕形成,损伤区囊腔样变。2免疫组化结果2.1TNF-α的表达2.1.1TNF-α在脊髓损伤中心表达最明显， A组表达最少，B组表达最多，术后3d、7d、14d，A组阳性细胞数分级分别为（7.833±1.169，5.833±0.752，4.833±1.471），染色强度分别是(0,0,0)，IHS分别是（0,0,0）。B组阳性细胞数分级分别为（86.333±1.211,79.666±1.032,67.666±1.632）,染色强度分别是（3,3,3）,IHS分别是（12,12,9）。小剂量时作用不明显，C组阳性细胞数分级分别为（85.166±1.169，78.166±0.752，66.333±1.366），染色强度分别是(3,3,3)，IHS分别是（12,12,9）。相同时间，其余剂量组随剂量增加，阳性细胞数减少，染色减低。D组阳性细胞数分级分别为（82.166±1.169,74.00±0.894,62±1.549）,染色强度分别是(3,2.5,2), IHS分别是（12,7.5,6）;E组阳性细胞数分级分别为（79.00±0.894,70.33±1.505,58.166±1.169）,染色强度分别是(2.5,2.5,2), IHS分别是(10,7.5,6); F组阳性细胞数分级分别为(75.00±0.894,65.666±1.632,54.5±1.516),染色强度分别是(2,2,1), IHS分别是(6,6,3); G组阳性细胞数分级分别为(73.833±0.752,64.666±1.940,53.166+1.169),染色强度分别是(2,2,1), IHS分别是(6,6,3); H组阳性细胞数分级分别为(72.666±0.333,62.666±1.751,52.00+1.414),染色强度分别是(2,1,1), IHS分别是(6,3,3)。2.1.2术后3d、7d、14d，A组分别与各组比较均有显著性差异(P<0.05)。术后3d、7d、14d,B组与各剂量组相互比较，发现早期小剂量给药时效果不明显，B组与C组（P=0.813,P=0.224,P=0.889,P>0.05)比较无明显差异；B组与D、E、F、G、H组均有明显差异（P<0.05）。各剂量组间（C、D、E、F、G、H组）比较， C、D、E、F组比较均有有统计学意义(P<0.05)，F、G、H组比较无统计学意义。术后3d，F组与G组(P=0.388,P>0.05)，G组与H组(P=0.327,P>0.05)，F组与H组(P=0.054,P>0.05)比较均无统计学意义;术后7d，F组与G组(P=0.922,P>0.05)，G组与H组(P=0.936,P>0.05)，F组与H组(P=0.162,P>0.05)比较均无统计学意义;术后14d，F组与G组(P=0.807,P>0.05)，G组与H组(P=0.879,P>0.05)，F组与H组(P=0.192,P>0.05)比较均无统计学意义。在一定范围内随着给药剂量的增加，差异较明显，当达到一定剂量后差异无明显变化，说明存在最适作用剂量。2.2IL-6的表达2.2.1IL-6表达阳性细胞也主要位于损伤中心区，在周边区逐渐减少。术后3d、7d、14d，A组未见或很少见阳性细胞，随时间无明显变化，阳性细胞数分级分别是（4.83±1.16，4.50±0.54，3.33±0.81），细胞显色强度分别是（0，0，0），IHS分别为（0，0，0）；B组表达最多，且染色强度最大，术后3d，小剂量组阳性细胞数最多，但是差异不明显，随胡椒碱剂量的增加阳性细胞数逐渐减少，细胞显色强度有所减低，B、C、D、E、F、 G、 H组阳性细胞数分级分别为(85.166±3.656，83.833±0.752,77.166±1.471,73.333±1.032,68.00±1.788,66.666±1.632,64.833+1.169)，细胞显色强度分别是(3,3,3,2.5,2.5,2,2), IHS分别为(12,12,12,10,6,6,6)。术后7d各剂量组阳性细胞减少，随着剂量增加阳性细胞数逐渐减少，细胞显色强度逐渐减低，差异比较明显, B、C、D、E、F、G、H组阳性细胞数分级分别为(81.833±1.471,80.333±1.505,73.166±2.228,67.166±1.940,60.666±1.211,59.000±1.141,57.833±0.983),细胞显色强度分别是(3,3,2.5,2.5,2,2,1)，IHS分别为(12,12,12,7.57.5,6,6)。术后14d，阳性细胞数明显减少，基本稳定，仍高于A组，B、C、D、E、F、G、H组阳性细胞数分级分别为(74.50±0.836,73.833±0.752,69.833±1.602,63.666±1.211,57.00±3.033,55.333±1.366,53.5±1.378)，细胞显色强度分别是(3,3,2,2,1,1,1)，IHS分别为(9,9,6,6,3,3,3)。2.2.2术后3d、7d、14d，A组分别与各组比较均有显著性差异(P<0.05)。术后3d、7d、14d,B组与各剂量组相互比较，早期小剂量给药时效果不明显，B组与C组（P=0.998,P=0.787,P=0.921,P>0.05)比较无明显差异；B组与C、D、E、F、G、H组均有明显差异（P<0.05）。各剂量组间（C、D、E、F、G、H组）比较， C、D、E、F组比较均有有统计学意义(P<0.05)，F、G、H组比较无统计学意义。术后3d，F组与G组(P=0.952,P>0.05)，G组与H组(P=0.501,P>0.05)，F组与H组(P=0.083,P>0.05)比较无统计学意义;术后7d，F组与G组(P=0.522,P>0.05)，G组与H组(P=0.829,P>0.05)，F组与H组(P=0.052,P>0.05)比较无统计学意义;术后14d，F组与G组(P=0.969,P>0.05)， G组与H组(P=0.453,P>0.05)， F组与H组(P=0.361,P>0.05)比较无统计学意义。结论：胡椒碱对脊髓损伤的保护作用可能与胡椒碱能够下调炎症介质TNF-α、IL-6的表达，从而减低炎症反应有关。