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目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)病理表现为:患者脑内Aβ聚集形成淀粉样斑块;tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结;神经元丢失。临床表现为记忆丢失,进行性认知障碍。大鼠海马内注射Aβ25-35可以导致学习记忆和认知功能下降,是一种广泛用于研究AD的动物模型。APPswe/PS1dE1转基因小鼠(APP/PS1小鼠)过度表达变异的淀粉样蛋白前体(amyloid protein precursor,APP)和γ分泌酶(γ-secretase),导致Aβ病理样过度累积,可模拟AD的主要病理变化,如老年斑沉积、神经纤维缠结等,是研究AD病理机制和药物筛选的理想模型。PDE4能够特异性催化水解第二信使环磷酸腺苷(cycle adenosine monophosphate,cAMP),腺苷酸环化酶(AC)催化三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)合成cAMP。PDE4与AC相互协调,共同维持细胞内cAMP浓度平衡。第二信使cAMP介导众多神经递质的胞内信号,具有重要的生理、病理意义。大量研究表明适度升高细胞cAMP水平具有改善学习记忆的功能,经典PDE4抑制剂咯利普兰已表现出显著的记忆改善作用,但其严重的致恶心呕吐不良反应阻碍了其在临床上的应用。为克服传统PDE4抑制剂致恶心呕吐的不良反应,本课题组在研究了 PDE4酶的结构、活性催化方式等后,自主研发合成新的化合物—氯比普兰。前期酶活性抑制率研究发现,氯比普兰对PDE4酶表现出良好的选择性,对PDE4酶活性催化中心的抑制率略高于咯利普兰。在对氯比普兰致呕吐潜能考察发现,氯比普兰具有极低的致呕吐潜能。随后的研究又发现氯比普兰能对抗东莨菪碱引起的记忆障碍[12],提示氯比普兰具有改善记忆的潜质。本课题旨在使用脑立体定位微量注射Aβ25-35建立的大鼠学习记忆障碍模型以及APP/PS1小鼠模型,研究新型磷酸二酯酶4抑制剂氯比普兰对学习记忆的改善作用及机制。方法1、AD大鼠实验方法:成年雄性Sprague-Dawley大鼠60只,体重在250-300g之间。适应性饲养一周,随机分为6组,每组10只。分为假手术对照(生理盐水注射)组,模型组(Aβ25-35注射)组,Aβ25-35注射+盐酸多奈哌齐组(1.0 mg·kg-1·d-1),Aβ25-35 注射+咯利普兰组(0.5 mg·kg-1·d-1),Aβ25-35 注射+氯比普兰低剂量组(0.05 mg·kg-1·d-1),Aβ25-35注射+氯比普兰高剂量组(0.15 mg·kg-1·d-1)。脑立体定位注射Aβ25-35(10μg,2 μl)造成AD大鼠模型,假手术组注射生理盐水2 μl。术后24 h开始灌胃给予相应药物,假手术组和模型组每天灌服等容积的空白溶剂。每天给药一次,连续给药23 d。第13d开始行为学测试,包括敞箱实验、水迷宫实验、避暗实验。行为学测试完毕后,进行分子生物学实验,包括酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测大鼠海马组织cAMP浓度,免疫印迹法(western blotting,WB)检测氯比普兰对大鼠海马组织磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(phosphorylated cAMP response-element binding protein,pCREB)、cAMP 依耐性蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase A,PKA),脑源性神经生长因子(brain dereived neurotrophic factor,BDNF)蛋白水平的影响,实时荧光定量聚合酶链反应法(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测氯比普兰对大鼠海马BDNF mRNA基因水平的影响。2、APP/PS1小鼠实验方法:对2月龄APP/PS1小鼠子代进行基因型鉴定,根据是否含突变型APP和PS1基因将小鼠分为转基因型和野生型。选取APP/PS1转基因型小鼠40只,同源野生型小鼠8只。APP/PS1小鼠随机分为空白溶剂组、氯比普兰低剂量组(0.10 mg·kg-1)、氯比普兰中剂量组(0.20 mg·kg-1)、高剂量组(0.40mg·kg-1)、阳性药咯利普兰组(0.50 mg·kg-1),野生型小鼠为阴性对照,每组8只。6月龄时灌胃给予相应的药物,给药23天后进行行为学测试,采用水迷宫检测小鼠学习记忆能力,敞箱实验测试小鼠的自主活动能力。行为学实验结束后采用ELISA试剂盒检测小鼠海马组织cAMP浓度,Western blotting检测海马PKA、CREB磷酸化水平以及BDNF蛋白水平,利用real-time PCR分析海马、皮层组织BDNFmRNA水平。结果1、AD大鼠实验结果1.1行为学结果表明,氯比普兰不影响大鼠白主活动能力;可以改善AD大鼠空间认知障碍;缓解大鼠对伤害性电刺激的被动回避。敞箱实验,各组大鼠无论是垂直得分还是水平得分,各组大鼠两两之间相互比较,其差异均不具有显著性(P>0.05)。水迷宫实验,各组大鼠水迷宫穿越平台次数,与假手术组相比,模型组大鼠穿越平台次数显著减少(P<0.05),提示模型建立成功;与模型组相比,0.15mg·kg-1·d-1氯比普兰、咯利普兰、多奈哌齐穿越平台次数均显著性增多(P<0.05)。水迷宫目标象限停留时间百分比,与假手术组相比,模型组大鼠在目标象限的停留时间百分比显著减少(P<0.05);与模型组相比,氯比普兰高剂量、咯利普兰、多奈哌齐组目标象限停留时间百分比均显著性增多(P<0.05)避暗实验,电击后24小时,与假手术组相比,模型组大鼠24h潜伏期显著性缩短(P<0.05),与模型组相比,氯比普兰低剂量、高剂量、咯利普兰、多奈哌齐组潜伏期均显著性延长(P<0.05)1.2分子生物学结果表明,氯比普兰能激活大鼠海马cAMP/PKA/CREB信号通路,促进BDNF的转录与翻译。Mouse/Rat cAMP Assay ELISA试剂盒结果显示,与假手术组相比,模型组海马组织cAMP浓度显著下降;与模型组相比,氯比普兰低剂量、高剂量、咯利普兰、多奈哌齐组显著性提高cAMP浓度(P<0.05)。WB结果显示:与假手术组相比,模型组海马部位PKA、CREB磷酸化水平、BDNF表达水平显著下降;与模型组相比,氯比普兰低剂量和高剂量、咯利普兰显著性对抗Aβ25-35造模引起的p-PKA、BDNF水平下降(P<0.05),多奈哌齐不能显著性增加p-PKA、BDNF水平(P>0.05)。与模型组相比,氯比普兰低剂量、高剂量、咯利普兰、多奈哌齐组显著性对抗Aβ25-35造模引起的p-CREB水平下降(P<0.001)。Real-time PCR结果表明,与假手术组相比,模型组海马组织中BDNF mRNA表达量显著性降低,与模型组相比,氯比普兰低剂量有增加BDNF mRNA表达量的趋势,但差异并无显著性,氯比普兰高剂量、咯利普兰显著性增加BDNF mRNA表达量(P<0.001),多奈哌齐对BDNF mRNA表达量无显著性影响。2、APP/PS1鼠实验结果2.1行为学结果表明,氯比普兰不影响APP/PS1小鼠自主活动能力;可以改善同月龄APP/PS1小鼠空间认知障碍。敞箱实验,无论是垂直得分还是水平得分,各组小鼠两两之间相互比较,其差异均不具有显著性(P>0.05)。水迷宫实验,小鼠水迷宫穿越平台次数,与WT组相比,空白组小鼠穿越平台次数显著减少(P<0.001);与空白组相比,氯比普兰低、中剂量穿越平台次数无显著性差异(P>0.05),氯比普兰高剂量、咯利普兰穿越平台次数显著性增多(P<0.01)。各组小鼠水迷宫目标象限停留时间百分比,与WT组相比,空白组小鼠在目标象限的停留时间百分比显著减少(P<0.001);与空白组相比,氯比普兰低剂量目标象限停留时间百分比无显著性差异(P>0.05),氯比普兰中、高剂量目标象限停留时间百分比显著性增多(P<0.05)。2.2分子生物学结果表明,氯比普兰激活APP/PS1小鼠海马cAMP/PKA/CREB信号通路,促进促进BDNF的转录与翻译。Mouse/Rat cAMP Assay ELISA试剂盒结果显示,与WT组相比,空白组小鼠海马组织cAMP浓度显著下降(P<0.001);与空白组相比,氯比普兰中、高剂量、咯利普兰显著性提高cAMP浓度(P<0.05-0.001)。WB结果显示:与WT组相比,空白组小鼠海马部位PKA和CREB磷酸化水平显著下降(P<0.05)。与空白组相比,氯比普兰低剂量p-PKA水平无显著性差异(P>0.05),氯比普兰中、高剂量,咯利普兰显著性升高p-PKA水平(P<0.05);氯比普兰低、中、高剂量,咯利普兰显著性升高p-CREB水平(P<0.05),氯比普兰高剂量,咯利普兰显著性升高BDNF蛋白水平(P<0.01)。Real-time PCR结果表明,与WT组相比,空白组海马组织中BDNFmRNA表达量显著性降低(P<0.05)。与空白组相比,氯比普兰低、中剂量BDNFmRNA表达量无显著性差异(P>0.05),氯比普兰高剂量、咯利普兰可显著性增加BDNF mRNA表达量(P<0.05)。结论氯比普兰有显著改善AD大鼠、APP/PS1小鼠学习记忆障碍的作用,该效应可能与升高大鼠、APP/PS1小鼠海马cAMP浓度,激活海马PKA/CREB信号通路,促进BDNF的表达有关。