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鳜（Siniperca chuatsi）,俗称“桂花鱼”,属鲈形目,鳜属,为我国重要的经济食用鱼类。近些年养殖规模的增大,传染病爆发已经给鳜的养殖业带来重创,如何有效防治传染病已经成为鳜养殖业持续发展首要面临的难题。免疫疫苗是现在预防鱼类传染病最有效的办法之一。细胞培养灭活疫苗因操作简单、成本低廉等优点被广泛应用于渔用疫苗的生产中。鳜的流行病病因复杂多样,一般由多种病因引起,单一抗原的疫苗已经不能满足市场需求。本研究以研制传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）和弹状病毒（SCRV）二联灭活疫苗为目的,筛选了对病毒敏感的培养细胞,确定灭活剂对病毒的灭活条件,建立了弹状病毒双抗体夹心抗原检测方法,最后免疫鳜用荧光定量法研究免疫因子表达量的变化,初步探讨二联灭活疫苗引起鱼体产生的特异性免疫反应通路,为阐明ISKNV&SCRV二联灭活疫苗诱导鳜免疫应答机制奠定了基础。具体实验结果如下:（1）为培养出适合制作疫苗的高价病毒,本研究采用纸片分离法从具有多形态的鳜脑组织细胞（CPB）中分离纯化出两株形态单一的细胞,分别命名为CPB-E1和CPB-F1。采用活细胞计数法测量两株细胞的生长曲线,发现CPB-E1第7d进入衰亡期,CPB-F1第5d进入衰亡期,CPB-E1生长期更长,更适合病毒的增殖。再将ISKNV和SCRV两种病毒分别接种到两株细胞上比较两株细胞对于病毒的敏感度,病毒滴度结果显示,CPB-E1生产ISKNV、SCRV病毒的滴度分别为:107.63TCID50/mL和1012.67TCID50/mL。CPB-F1生产ISKNV、SCRV病毒的滴度分别为:106.92TCID50/mL和1012.33TCID50/mL。CPB生产ISKNV、SCRV病毒的滴度分别为:106.5TCID50/mL和1011.39TCID50/mL。CPB-E1细胞得到的病毒滴度均高于CPB-F1和CPB,综上所述,选择更适合病毒生长且敏感的CPB-E1作为后续实验所用细胞。（2）本研究选用目前在灭活病毒方面常用的甲醛和BPL对ISKNV和SCRV病毒进行灭活,确定最适的二联灭活疫苗灭活条件。以终浓度分别为0.5‰、1‰、2‰的BPL溶液4℃和终浓度为2‰,1‰的甲醛溶液,28℃,80r/min分别灭活SCRV病毒4h、6h、12h、24h、48h、72h。以终浓度0.5‰、1‰的BPL溶液4℃和终浓度为2‰,1‰的甲醛溶液,28℃,80r/min灭活ISKNV病毒4h、6h、12h、24h、48h、72h。将灭活后的病毒盲传三代观察病变,进行鱼体安全试验。结果显示终浓度为2‰的BPL溶液在4℃灭活72h和终浓度2‰或1‰的甲醛溶液在28℃分别灭活6h或12h可以完全灭活SCRV病毒。1‰的BPL4℃灭活6h和2‰的甲醛28℃灭活72h可以完全灭活ISKNV病毒。（3）为了检测灭活疫苗抗原含量,将纯化SCRV病毒及重组G蛋白分别免疫小鼠,经融合、克隆、筛选,共获得单克隆杂交瘤细胞9株,经抗体亚型、表位筛选等生物学特性鉴定后,确定4E121F3和4H81F11能够较好的识别SCRV病毒。将4H81F11作为包被抗体,4E121F3进行生物素标记作为检测抗体,,建立双抗体夹心ELISA检测方法。此方法测得的标准曲线有理函数为y=（a+bx）/（1+cx+dx^2）（R=0.999）,最低检出限为15.6ng/mL。使用该方法对梯度稀释的病毒液进行检测,发现该法测定的抗原含量与病毒滴度呈正相关,抗原含量可以敏感显示出病毒滴度的变化,说明此方法是可靠的,可以用来检测疫苗中SCR V病毒的抗原含量。（4）用ISKNV&SCRV二联灭活疫苗免疫健康鳜,在免疫后7d,14d,取头肾和脾脏,荧光定量PCR检测MHCI、MHCII、CD4、CD8、IgM等几种特异性免疫因子的表达量,以此探究二联灭活疫苗引起鳜特异性免疫应答的机制。结果显示这几种因子在14d的表达量普遍高于7d时的表达量。M HCI在14d时头肾中显著上调表达4.9倍（P<0.05）,脾中极显著上调3.3倍（P<0.01）。CD8在头肾中14d时表达量最高,显著上调4.0倍（P<0.05）,在脾中为抑制表达。MHCII在头肾中表达上调,7d显著上调1.5倍（P<0.05）,14d上调1.6倍,在脾中7d下调表达,14d略微上调表达。CD4在头肾中表达量极显著上调,7d、14d表达量分别为4.8倍和9.5倍（P<0.01）,在脾中7d时表达量下调表达,在14d为显著下调（P<0.05）。IgM在头肾中的表达量均为上调,7d时显著上调1.2倍（P<0.05）,14d上调2.0倍。以上结果表明ISKNV&SCRV二联灭活疫苗成功诱导鱼体产生了细胞免疫和体液免疫,激发了MHC型复合体介导的免疫通路。