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鳜是我国主要的高值经济养殖鱼类之一,随着养殖密度的提高,病害越发严重,其中鳜传染性脾肾坏死病毒病(ISKNVD)和弹状病毒病(SCRVD)是阻碍鳜养殖业健康发展的最主要病毒病,因此对其开展防治研究非常必要。p53是一种重要的肿瘤抑制因子,具有调节细胞周期、控制细胞死亡和分化、参与细胞凋亡等功能。近年来研究发现,p53蛋白在细胞先天性抗病毒免疫中发挥着重要的作用。本论文以鳜为研究对象,克隆、表达了鳜p53基因,制备了其多克隆抗体,在此基础上,开展了p53对ISKNV和SCRV感染的响应模式研究,并进一步对其抗病毒功能进行了确定。取得的结果如下:1、获得了鳜p53序列并制备其多克隆抗体,探讨了鳜p53对ISKNV和SCRV感染的响应模式。鳜p53(Sc-p53)的cDNA全长为1,555 bp,编码380个氨基酸,5’和3’非编码区分别为165 bp和247 bp。Sc-p53蛋白同其他物种p53蛋白一样,在结构上也含有5个进化上高度保守的区域,是p53功能的关键位点。系统进化分析表明,鳜p53与雀鲷等鲈形目亲缘关系最近。构建了鳜p53原核表达载体p ET30a-Scp53,将其转化大肠杆菌BL21,在IPTG的诱导下表达了Sc-p53,Sc-p53蛋白以包涵体形式存在。将纯化的Sc-p53重组蛋白免疫兔子,制备了抗Sc-p53的兔多克隆抗体。荧光定量PCR检测健康鳜的Sc-p53 m RNA在各个组织中呈组成型表达,主要表达于鳃和后肾。Western blotting检测发现健康鳜的Sc-p53在肝脏、鳃、脾脏、胃和心脏中表达。ISKNV感染鳜后,Sc-p53在鳜脾脏中表达呈现双相性上升的变化,在感染3 h时表达显著上调,随后表达下降,然后在48 h至7 d表达再次显著上调;ISKNV感染鳜脑细胞(CPB)后的表达趋势与鳜脾脏情况相似。Western blotting检测结果显示ISKNV感染CPB细胞后p53蛋白水平也呈现双相性上升的变化。然而,SCRV感染鱼体和细胞后Sc-p53表现出不同的表达模式。SCRV感染鳜后在脾脏组织中表达情况是感染24 h后表达显著上调,而感染CPB细胞后,Sc-p53在感染6 h表达显著上调。Western blotting检测SCRV感染CPB后,p53蛋白在感染1 h后表达显著上调,持续上升到感染4 h,而后下降。2、获得了鳜p53的基因组结构及其一种新的剪接异构体(Sc-p53I6),在此基础上进一步探讨了Sc-p53I6对ISKNV和SCRV感染的响应模式。鳜p53基因组全长为5,543 bp,包含10个内含子和11个外显子。采用RACE-PCR的方法获得了鳜p53的一种新的剪接异构体(Sc-p53I6),其cDNA全长为1,106 bp,编码254个氨基酸,5’和3’非编码区分别为165 bp和179 bp。相比Sc-p53,Sc-p53I6的cDNA全长少了5个外显子,并保留了第六个内含子的一部分。荧光定量PCR检测发现Sc-p53I6在健康鳜的各个组织中也呈组成型表达,主要表达于鳃、血细胞和后肾中。Western blotting结果显示Sc-p53I6在健康鳜的肝脏、头肾、中肾、胃和心脏中表达。ISKNV感染鳜后,Sc-p53I6在鳜脾脏中的转录表达也呈现双相性上升的变化,在感染6 h表达显著上调,随后表达下降,然后在48-72 h表达再次显著上调;ISKNV感染鳜脑细胞后的转录表达趋势与鳜脾脏表达趋势相似。SCRV感染鳜后Sc-p53I6在脾脏组织中转录表达情况呈现出不同的表达模式,只表现一次上升的变化,感染12 h后表达显著上调;感染CPB细胞后在感染4 h表达显著上调。3、为了研究鳜p53的抗病毒功能,构建了鳜p53敲降CPB细胞系,在此基础上,进一步探讨了鳜p53敲降CPB细胞系对ISKNV和SCRV病毒增殖复制的影响。首先构建了p53基因的RNA干扰真核表达载体p MAGic-Scp53A和p MAGic-Scp53B。将构建好的干扰载体转染CPB细胞,获得稳定转染细胞系,将其命名为CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B。通过荧光定量PCR和Western blotting检测其干扰效率,qRT-PCR结果表明CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B干扰效率分别为63%、60%;Western blot结果表明,CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B干扰效率分别为79.42%、78.28%,表明成功获得了两个鳜p53敲降CPB细胞系。然后采用ISKNV和SCRV分别感染鳜p53敲降CPB细胞系,结果显示,与对照组相比,在CPB-p53kd-A和CPB-p53kd-B中,ISKNV和SCRV的病毒拷贝数及ISKNV-MCP和SCRV-N蛋白的表达均显著增加,且增加水平与敲降效率呈正相关。4、促进鳜p53表达抑制了ISKNV和SCRV病毒的增殖复制。添加5-氟尿嘧啶可以增强鳜p53蛋白的表达,ISKNV和SCRV感染后,与对照组相比,添加5-氟尿嘧啶组ISKNV和SCRV的病毒拷贝数及ISKNV-MCP和SCRV-N蛋白的表达均显著降低。综上所述,ISKNV和SCRV在鳜p53敲降CPB细胞系中的增殖复制显著增加,促进鳜p53表达后,ISKNV和SCRV病毒增殖复制显著降低。表明鳜p53在ISKNV和SCRV病毒增殖复制中发挥着重要的抗病毒作用。