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马铃薯是我国第五大粮食作物,现有栽培品种为普通栽培种(Solamum tuberosum L.),不耐霜冻,在生产过程中通常遭受霜冻而导致严重减产甚至绝收,而自然界中部分野生种材料耐冻能力强并且能通过短暂的冷驯化使耐冻性得到进一步提高,是改良普通栽培品种耐冻性的重要种质资源。随着近年来气候变化加剧,极端天气愈来愈频繁,引进马铃薯野生种质资源并评价其耐冻能力,挖掘植物自身的耐冻基因,解析耐冻机制,进而培育耐低温霜冻的马铃薯品种尤显必要。本研究利用耐冻马铃薯野生种S. acaule为实验材料,采用转录组测序技术,在国内首次进行了野生马铃薯冷驯化方面的研究,从耐冻性不同的3个马铃薯野生种中分离了不饱和脂肪酸合成途径中的关键脱氢酶基因SAD和FAD2基因,开发了SAD基因的CAPS标记并进行了耐冻相关性验证,为马铃薯耐冻性分子标记辅助选择提供理论依据。同时将SAD基因通过根癌农杆菌转化法导入马铃薯普通栽培种中薯8号中,明确了SAD基因在低温调控中的功能及其作用,所得主要结果如下：(1)对冷驯化前后的野生马铃薯S. acaule材料03079-435幼苗进行转录组测序,注释了69866个基因,其中有3303个基因上调,4511个基因下调,共涉及到124个代谢通路。寒冷诱导相关基因,如脱落酸、赤霉素、乙烯、茉莉酸、胚胎晚期丰富蛋白、热激蛋白和碱性亮氨酸拉链和不饱和脂肪酸脱氢酶等基因在冷驯化前后表达差异明显。对其中15个耐冻相关基因的qRT-PCR验证结果表明,15个基因的表达趋势与转录组分析结果相符率为80%。这为我们进一步的研究与分析奠定了基础。(2)从3个耐冻性差异较大的野生马铃薯S. commersonii、S. cardiophyllum和S. acaule中分别克隆出SAD和FAD2基因,首次报道了SAD基因和FAD2基因在耐冻和冷冻敏感的马铃薯野生种中存在的氨基酸残基差异。二级结构预测结果表明耐冻且有冷驯化能力的S. commersonii和S.acaule的FAD2蛋白与冷冻敏感的S. cardiophyllum FAD2蛋白的α-螺旋、延伸链和随机卷曲存在明显差异,而三个耐冻性不同的野生马铃薯SAD基因编码的蛋白都含有52.67%的α-螺旋、8.91%的延伸链和38.42%的随机卷曲。三级结构预测表明,野生马铃薯的SAD蛋白是一个亲水性的球状蛋白。SAD基因和FAD2基因在耐冻的野生种S. commersonii和S. acaule中的上调表达显著高于冷冻敏感的S. cardiophyllum的表达量,可能是SAD基因和FAD2基因上调表达增加了不饱和脂肪酸的含量从而提高膜脂质的流动性,最终使得S. commersonii和S. acaule耐冻性得到进一步的提高。(3)以两个耐冻性和冷驯化能力不同的二倍体野生马铃薯S. commersonii (cmml)和S.cardiophyllum (cphl2)为材料,开发了SAD基因的CAPS标记并进行验证。根据已有的马铃薯SAD基因cDNA序列在茄科基因组资源网站上进行比对,获得相似度高达97.43%的一段长度为4849bp的基因组序列。共设计了7对引物覆盖该序列,其中P7引物对的PCR产物测序发现在cmml和cph12的SAD基因片段间18个SNP位点中含有一个EcoR I的酶切位点。根据该酶切位点,开发了SAD基因的CAPS标记,命名为SAD-EcoR I。利用这个CAPS标记对cmm1、cph12、F1066和57个BCl后代的标记类型与冷驯化能力进行了相关分析,发现该标记与材料的冷驯化能力极显著相关,这表明该标记可以应用于马铃薯耐冻性育种的分子标记辅助选择。(4)将来自野生种S.commersonii的SAD基因转入中薯8号中进行功能验证。首先从野生种S.commersonii和中薯8号的cDNA中分别克隆了SAD基因,序列分析表明两者之间的SAD基因蛋白序列存在7处氨基酸残基差异。将来自于野生种S.commersonii的SAD基因命名为SAD-CMM。利用pBIl21成功构建了SAD-CMM基因的表达载体,并通过根癌农杆菌将pBIl21-SAD-CMM和pBI121空载导入中薯8号中,以马铃薯微型薯薯片为外植体进行诱导并获得阳性转基因苗。耐冻性鉴定结果表明SAD-CMM基因的导入有助于中薯8号的冷驯化能力的提高。对转基因植株的脂肪酸成分分析表明,冷驯化处理后SAD-CMM基因的超量表达显著增加了转基因植株的亚油酸含量,这暗示亚油酸含量对马铃薯植株耐冻性的提高有重要作用。